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嘉峪檢測網 2025-02-19 20:10
摘 要： 建立了超高效液相色譜-串聯質譜法快速檢測蜂蜜中10種氨基甲酸酯類農藥殘留。采用乙腈提取，中性氧化鋁固相萃取柱凈化，采用Alphasil VC-C18柱分離，以2 mmol/L甲酸銨-0.01 %甲酸水溶液-甲醇溶液作為流動相進行梯度洗脫，流量為0.2 mL/min，多反應監測模式檢測。10種目標物的質量濃度在5.0～100 μg/L的范圍內與色譜峰面積線性關系良好，相關系數均大于0.99，檢出限為0.78～1.0 μg/kg。樣品加標平均回收率為64.71～103.10 %，測定結果的相對標準偏差為2.08%～5.62 %（n=6）。該方法簡便、快速，靈敏度、準確度高，能夠滿足蜂蜜中10種氨基甲酸酯類多農殘的高通量檢測分析要求。
關鍵詞： 超高效液相色譜-質譜法； 氨基甲酸酯類； 農藥殘留； 蜂蜜
蜂蜜不僅具有較好的保健功能，還有較高的營養價值，是人們喜愛的蜜蜂產物。與其他農副食品產業情況不同，蜂蜜因其生產特殊性，產品容易受到農藥殘留影響。當大量施播農藥時，自然界中可能存在農藥殘留，蜜蜂在采蜜過程中會接觸到這些殘留農藥。一部分蜜蜂死亡，一部分蜜蜂將殘留帶到蜂巢中，不僅提高了蜜蜂的抗藥性，還可能影響、污染蜂巢環境，包括蜂王的產卵行為、工蜂分工行為、蜜蜂采蜜行為、同群和外群工蜂識別功能及蜂群的學習行為，最終可能對蜂蜜的質量和食用者的健康產生負面影響。
自20世紀70年代以來，隨著有機氯農藥的禁用或限用，抗有機磷農藥的昆蟲品種日益增多。2007年，5種高毒有機磷農藥的禁用進一步推動了氨基甲酸酯類農藥的開發，這類農藥旨在彌補有機氯和有機磷農藥的缺陷，成為一種新型的廣譜殺蟲劑、殺螨劑和除草劑。然而，某些氨基甲酸酯類農藥的毒性極大，例如涕滅威和克百威已被國家列為禁用農藥，速滅威和殘殺威等則被報道對蜜蜂具有高毒性。因此，氨基甲酸酯類農藥的不科學使用常導致人畜中毒事件的發生[1]。目前該類農藥殘留檢測主要集中在植物源性食品及環境檢測的水、土壤中[2-3]，對于動物源性食品中氨基甲酸酯類農藥多殘留的高通量分析方法與文獻報道卻十分少見[4-5]，不能完全監控易受農殘影響的蜂蜜中氨基甲酸酯類農殘質量安全，勢必會造成蜂產品質量安全監管的缺失。
有關氨基甲酸酯類農殘檢測方法報道很多，常用的包括氣相色譜(GC)法[6]、氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)法[7-9]、高效液相色譜(HPLC)法[10-12]、高效液相色譜-質譜聯用(HPLC/MS)法[13-15]、超臨界色譜(SFC)法和薄層色譜(TLC)法[16]等。然而因為樣品復雜基質的影響，HPLC、GC方法很難將農殘多組分完全分離，且衍生過程較為繁瑣，檢測限相對較高；TLC法對生物高分子分離效果不甚理想；SFC法流體自身穩定性不佳，使用條件苛刻，重現性不佳，成本又較為高昂；GC-MS法因氨基甲酸酯類農藥在高溫下本身不穩定的特性而直接被限制；HPLC/MS法具有靈敏度高、檢出限低、抗干擾能力強、分析速度快等特點，近年已逐步成為氨基甲酸酯類農藥檢測的首選方法[17-19]。
筆者通過優化儀器條件和樣品前處理過程，建立了超高效液相色譜-串聯質譜法快速檢測蜂蜜中氨基甲酸酯類農藥殘留，該方法簡便、高效，靈敏度、準確度高，可用于蜂蜜中10種氨基甲酸酯類多農殘的高通量檢測分析。
1. 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
液相色譜-串聯質譜儀：LCMS-8050型，日本島津儀器有限公司。
多樣品渦旋混合器：MultiVortex型，廣州得泰儀器科技有限公司。
旋轉蒸發儀：HB 10 S96型，德國艾卡集團有限公司。
高速冷凍離心機：GL-20G-Ⅱ型，上海安亭科學儀器有限公司。
電子天平：ATY224型，感量為0.1 mg，日本島津儀器有限公司。
超純水系統：Milli-Q DirectB型，德國默克密理博有限公司。
LC-C18固相萃取柱：500 mg（6 mL），上海安譜實驗科技股份有限公司。
NH2固相萃取柱：500 mg（6 mL），上海安譜實驗科技股份有限公司。
中性氧化鋁固相萃取柱：1 000 mg（3 mL），深圳逗點生物技術有限公司。
乙腈、二氯甲烷、甲醇：均為色譜純，美國霍尼韋爾國際公司。
甲酸：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司。
甲酸銨、氯化鈉：均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。
農藥混合標準品溶液：含滅多威、克百威、3-羥基克百威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、速滅威、甲萘威、異丙威、仲丁威，各組分質量濃度均為100 μg/mL，批號為23050036，壇墨質檢標準物質中心。
蜂蜜樣品：陜西產地，散裝農家土蜂蜜。
實驗用水為超純水系統制備實驗室用一級水。
1.2 儀器工作條件
1.2.1 液相色譜儀
色譜柱：Alphasil VC-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm，華譜科儀大連科技有限公司）；柱溫：35 ℃；進樣體積：5 μL；流動相：A相為2 mmol/L甲酸銨-0.01%甲酸水溶液，B相為甲醇溶液，流量為0.2 mL/min；；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
Tab. 1 Program of gradient elution
注：A相為2 mmol/L甲酸銨-0.01%甲酸水溶液，B相為甲醇溶液。
1.2.2 質譜儀
離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測模式(MRM)；接口電壓：3.0 kV；接口溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；加熱氣流量：10 L/min；干燥氣流量：10 L/min；霧化氣流量：3 L/min，10種農藥殘留的質譜參數表2。
表2 10種農藥殘留的質譜參數
Tab. 2 Mass spectrum parameters of 10 pesticide residues
注：帶*的為定量離子。
1.3 實驗步驟
1.3.1 樣品預處理
稱取2 g蜂蜜樣品(精確到0.001 g)于50 mL離心管中，加入10 mL水渦旋混勻1 min，靜置5 min，再加入15 mL乙腈渦旋混勻1 min，以10 000 r/min離心5 min，轉移上層溶液到另一個50 mL離心管中。殘渣再次加入15 mL乙腈，重復提取一次，合并兩次提取上清液，在合并液中加入過量NaCl渦旋混勻1 min，再以10 000 r/min離心5 min，轉移上層乙腈相到濃縮瓶中，旋轉蒸發至近干，殘渣用2 mL二氯甲烷-甲醇(95∶5，體積比，下同)溶液溶解，待凈化。
用6 mL二氯甲烷-甲醇(95∶5)溶液活化中性氧化鋁SPE小柱，將上述待凈化液全部轉移上柱，收集流出液，再用二氯甲烷-甲醇(95∶5)溶液4 mL分2次洗瓶后過柱，最后用二氯甲烷-甲醇(95∶5)溶液2 mL洗脫，收集全部流出液，40 ℃氮吹至近干，用1 mL的體積分數為60%乙腈復溶，過0.22 μm濾膜作為樣品溶液。
1.3.2 溶液的配制
10種氨基甲酸酯類農藥混合標準中間液：吸取1.0 mL農藥混合標準品溶液，用甲醇稀釋定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 μg/mL的農藥混合標準中間液，于-20 ℃避光保存。
10種氨基甲酸酯類農藥系列混合標準工作溶液：準確吸取適量10種農藥混合標準中間液，用體積分數為60%的乙腈稀釋配制成質量濃度均分別為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列混合標準工作溶液，臨配現用。
1.3.3 樣品測定
將配制好的系列混合標準工作溶液和樣品溶液裝入1 mL液相色譜專用樣品瓶中，在1.2儀器工作條件下上機測定，以外標法定量。
2. 結果與討論
2.1 流動相的選擇
依據目標物特性選用了三種不同流動相，分別為甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-2 mmol/L甲酸銨-0.01%甲酸水溶液，通過考察流動相對色譜分離和靈敏度的影響，進而選擇最優流動相。試驗發現，當采用乙腈作為有機相時，滅多威、涕滅威砜、涕滅威亞砜等峰形變差，大多數農藥響應明顯不如甲醇做有機相。同時，在水相中添加甲酸和甲酸銨后，各化合物的離子化效率提高，靈敏度更好[20]，因此最終采用甲醇-2 mmol/L甲酸銨-0.01%甲酸水溶液作為流動相。通過再優化流動相梯度洗脫程序，10種氨基甲酸酯類農藥也得到了最佳分離，加標樣品總離子流色譜圖如圖1所示。
圖1 加標樣品總離子流色譜圖
Fig. 1 Total ion flow chromatogram of the labeled sample
1—克百威；2—仲丁威；3—滅多威；4—涕滅威；5—涕滅威砜；6—涕滅威亞砜；7—異丙威；8—速滅威；9—甲萘威；10—3-羥基克百威
2.2 固相萃取柱的選擇
蜂蜜樣品中含有大量糖類等內源性雜質，經過初步分離萃取之后，仍然有其他雜質可能被乙腈一并提取出來，干擾了目標組分，降低了檢測靈敏度，所以需要使用固相萃取(SPE)小柱對目標組分進行凈化。考察了C18柱、NH2柱、中性氧化鋁柱的分離凈化效果，結果表明，使用C18柱時雜質未能有效去除，滅多威、涕滅威、涕滅威亞砜等目標組分回收率極低；NH2柱的凈化效果稍好，但仍不理想；中性氧化鋁柱凈化效果最好，其中滅多威、涕滅威砜等回收率明顯優于NH2柱凈化效果，這是由于滅多威等極性較強，在NH2柱上有更大保留作用，不容易被洗脫下來，10種氨基甲酸酯類農藥的回收效果也都較好，因此最終選用中性氧化鋁柱作為氨基甲酸酯類農藥的凈化SPE小柱。
2.3 洗脫液體積的優化
將一定量加標樣品過中性氧化鋁柱，選用不同體積(0、2、5、8、12、15 mL)的二氯甲烷-甲醇(95∶5)溶液洗脫，合并收集洗脫液，氮吹至近干，再用60%乙腈復溶后進行色譜質譜分析。結果表明，洗脫液體積為2 mL時各目標物回收率均明顯高于其他洗脫液梯度回收率，這是因為滅多威等目標物極性較強，在SPE小柱上有較大保留作用，不易被洗脫下來，當洗脫液體積為2 mL時，目標物回收率最高；再增加洗脫液體積后所有目標農藥回收率快速下降，這可能由于洗脫液體積增大，進一步氮吹揮干時間增長，目標農藥不穩定導致待測物質損失，因此選擇洗脫液體積為2 mL。
2.4 線性方程及檢出限
取系列混合標準工作溶液，在1.2儀器工作條件下進樣分析，以目標組分峰面積(y)為縱坐標，以待測液農藥濃度(x)為橫坐標，繪制標準工作曲線，采用最低質量濃度標準工作溶液進樣分析，并計算信噪比，其中信噪比大于等于3為檢出限，信噪比大于等于10為定量限。10種氨基甲酸酯類農藥的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限見表3。由表3可知，10種目標物的質量濃度在線性范圍為5.0～100 μg/L的范圍內與色譜峰面積線性關系良好，相關系數均大于0.99，方法檢出限為0.78～1.0 μg/kg，表明該方法有較好的靈敏度。
表3 10種氨基甲酸酯類農藥的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限
Tab. 3 Linear range，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantitation limit of 10 kinds of carbamate pesticides
2.5 加標回收與精密度試驗
對空白樣品進行3個不同濃度水平(2.5、10.0、50.0 μg/kg)的加標回收試驗，每個濃度水平平行測定6次，在1.2儀器工作條件下進樣測定。加標回收與精密度試驗結果見表4，由表4可知，10種農藥的平均回收率為64.71%~103.10%，測定結果的相對標準偏差（RSD）為2.08%～5.62%(n=6)，依據GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》附錄F檢測方法分析技術要求，結果滿足多種農殘分析要求和實際檢測需要。
表4 加標回收與精密度試驗結果
Tab. 4 Results of standard recoveries and precision test
注：低、中、高3個加標水平濃度分別為2.5、10.0、50.0 μg/kg。
2.6 基質效應評價
基質效應(ME)評價主要是通過測定相同濃度梯度的空白基質標液與純溶劑標液中離子信號強度，比較基質標曲與純溶劑標曲的斜率進而評價效應的大小。基質效應按式(1)計算：
ME/%=(
-1)×100 (1)
當斜率比小于1，表示存在基質抑制；斜率比大于1，表示存在基質增強。其中斜率比在0.8～1.2之間(即|ME|在20%以內)時，通常認為是弱基質效應；斜率比在0.5～0.8或1.2～1.5之間(|ME|在20%～50%之間)時，可以認為是中等基質效應；而斜率比小于0.5或大于1.5時(|ME|超過50%)，則被認為是強基質效應。按1.3實驗步驟比較了濃度為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L時的基質標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率，結果表明，10種氨基甲酸酯類農藥的|ME|值均在20%之內，說明其基質效應存在但影響較弱，因此選用溶劑標準曲線進行定量校正。
3. 結語
建立了超高效液相色譜-串聯質譜法快速檢測蜂蜜中10種氨基甲酸酯類農藥殘留，該方法簡便、快速，且精密度和準確度均可滿足試驗要求。同時首次創新嘗試進行市售蜂蜜產品中多種氨基甲酸酯類農殘的風險監測，也為蜂蜜及蜂產品的質量安全日常監管提供了有力的技術支持。
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引用本文： 楊琦，房忠芳，孟虎，等 . 超高效液相色譜-串聯質譜法快速檢測蜂蜜中10種氨基甲酸酯類農藥殘留［J］. 化學分析計量，2024，33（11）：85. (YANG Qi, FANG Zhongfang, MENG Hu, et al. Rapid determination of 10 carbamate pesticide residues in honey by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(11): 85.)
來源：化學分析計量
