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嘉峪檢測網 2025-02-25 21:21
摘 要： 建立了高效液相色譜法同時測定除痰止嗽丸中白花前胡甲素、白花前胡乙素和橙皮苷的含量。采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分離，以乙腈-0.2%（體積分數）磷酸溶液作為流動相進行梯度洗脫，流量為1.0 mL/min，檢測波長分別為321 nm（白花前胡甲素、白花前胡乙素）、284 nm（橙皮苷），柱溫為30 ℃，進樣體積為5 μL。白花前胡甲素、白花前胡乙素和橙皮苷3種成分的質量在各自范圍內與色譜峰面積線性關系良好，相關系數均不小于0.999 5。樣品的平均回收率為96.90%～102.98%，測定結果的相對標準偏差為0.44%～0.90%（n=6）。該方法穩定性強、準確度高，可用于除痰止嗽丸的質量控制。
關鍵詞： 高效液相色譜法； 除痰止嗽丸； 白花前胡甲素； 白花前胡乙素； 橙皮苷
除痰止嗽丸是由前胡、陳皮、白術、法半夏、桔梗、黃芩、六神曲等18味藥物組成，具有清肺降火，除痰止嗽的功效[1]。成方制劑中前胡、陳皮均為君藥，前胡具有降氣止咳、疏散肺熱的作用，白花前胡甲素和白花前胡乙素為其香豆素類有效成分[2-5]；陳皮理氣化痰，橙皮苷為其黃酮類有效成分，具有抗炎、抗菌抗病毒等功效[6-9]。該藥的現行標準為《中華人民共和國衛生部藥品標準》中藥成方制劑第2冊(WS3-B-0365-90)，該質量標準僅對除痰止嗽丸進行性狀和顯微鑒別，未對方中任何藥物進行定性鑒別或者定量測定，不利于對藥材及制劑質量進行監測和控制。現有文獻對除痰止嗽丸質量標準提升研究甚少，只涉及了除痰止嗽丸測定一種或者兩種指標性成分(桔梗、前胡)的方法[10]，尚未查詢到除痰止嗽丸中3種指標成分同時進行含量測定的文獻。
筆者參考測定白花前胡甲素、白花前胡乙素和橙皮苷的方法[11-16]，建立高效液相色譜法同時測定除痰止嗽丸中白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷三種指標性成分的含量，為進一步提高除痰止嗽丸的質量標準提供參考。
1. 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：1260 Infinity II型，二極管陣列檢測器，美國安捷倫科技有限公司。
電子天平：（1）BSA224S型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯儀器有限公司；（2）XPR105DR型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。
超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司。
超純水制備系統：Milli-Q IQ7000型，美國密理博儀器有限公司。
白花前胡甲素對照品：質量分數為99.4%，批號為111711-201904，中國食品藥品檢定研究院。
白花前胡乙素對照品：質量分數為99.7%，批號為111904-202105，中國食品藥品檢定研究院。
橙皮苷對照品：質量分數為97.2%，批號為110721-202220，中國食品藥品檢定研究院；
甲醇、乙腈：均為色譜純，美國西格瑪化學公司。
磷酸：色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司。
除痰止嗽丸樣品：批號分別為20010706、20010566、20010110，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠。
除痰止嗽丸陰性樣品：北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠。
實驗用水均為超純水。
1.2 色譜條件
色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：30℃；檢測波長：白花前胡甲素、白花前胡乙素為321 nm、橙皮苷為284 nm；進樣體積：5 μL；流動相：A相為乙腈，B相為0.2%(體積分數)的磷酸水溶液，流量為1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
Tab. 1 Gradient elution program
1.3 溶液配制
1.3.1 混合對照品溶液
白花前胡甲素、白花前胡乙素對照品儲備溶液：取白花前胡甲素、白花前胡乙素對照品適量，精密稱定，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至標線，搖勻。
白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷混合對照品溶液：取橙皮苷對照品適量，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，再分別取白花前胡甲素、白花前胡乙素對照品儲備液1 mL加入容量瓶中，加入甲醇稀釋定容至標線，制成白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷的質量濃度分別為63.02、32.52、282.27 μg/mL的混合對照品溶液。
1.3.2 樣品溶液
取除痰止嗽丸樣品適量，剪成小塊，精密稱取3 g左右，加適量硅藻土研細，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞后稱定質量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz) 20 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減少質量，搖勻，濾過，作為樣品溶液。同法制備不含前胡和陳皮的陰性樣品溶液。
1.4 實驗方法
分別取混合對照品溶液、樣品溶液和陰性樣品溶液，在1.2儀器工作條件下進樣測定，記錄各溶液色譜峰面積，繪制標準工作曲線，以外標法計算樣品中白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷成分的含量。
2. 結果與討論
2.1 色譜柱的選擇
以乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動相，分別考察了Waters Symmentry-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)對3種指標成分的分離效果和色譜峰形。結果表明，當使用ZORBAXSB-C18柱時，基線平穩、分離度好，色譜峰形對稱，保留時間合適，因此選擇ZORBAXSB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)作為分析柱。
2.2 檢測波長的選擇
采用二極管陣列檢測器，在200～400 nm范圍內掃描混合對照品溶液，結果表明，白花前胡甲素和白花前胡乙素兩種成分在321 nm處吸收最大，橙皮苷在284 nm處吸收最大，結合分離度、色譜峰形、雜峰干擾等因素，將白花前胡甲素和白花前胡乙素的檢測波長定為321 nm，橙皮苷的檢測波長定為284 nm。
2.3 流動相的選擇
考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液3種流動相體系，采用等度或梯度洗脫的方式，測定樣品中3種指標性成分的含量。結果表明，使用上述3種流動相，色譜峰的峰形和分離度較差，保留時間較長；根據3種指標性成分的分子極性，通過梯度洗脫程序的優化，最終確定以乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫，色譜圖基線平穩，3種成分分離度良好，且保留時間適中。
2.4 樣品處理條件的優化
分別考察了甲醇、50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液、三氯甲烷作為提取溶劑，超聲處理30 min對白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷提取結果的影響，測定結果見表2。由表2可知，甲醇作為提取溶劑時提取效率最高，70%甲醇提取效率次之，而三氯甲烷不能有效提取3種成分，故選擇甲醇作為提取溶劑。
表2 不同提取溶劑時3種成分的測定結果
Tab. 2 Results of determination of 3 components in different extraction solvents
以甲醇為提取溶劑，考察超聲提取、加熱回流兩種方式對白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷3種成分的提取效果。結果表明，2種提取方式對除痰止嗽丸中3種成分測定結果無明顯影響，綜合考慮操作簡單，雜質峰較少等因素，選擇超聲提取作為樣品處理的方法。
以甲醇為提取溶劑，分別考察白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷3種成分在不同超聲時間(20、30、45、60 min)的提取效果，結果見表3。由表3可知，超聲20 min即可實現3種成分的有效提取，考慮到時間成本和提取效率，選擇超聲(500 W，40 kHz)時間為20 min。
表3 不同超聲時間3種成分的測定結果
Tab. 3 Determination results of 3 components at different ultrasonic time
2.5 方法專屬性
分別精密吸取5 μL對照品溶液、樣品溶液、陰性樣品溶液，在1.2色譜條件下進樣測定。樣品溶液、混合對照品溶液和陰性樣品溶液色譜圖如圖1所示。
圖1 樣品溶液、混合對照品溶液和陰性樣品溶液色譜圖
Fig. 1 Chromatogram of sample solution，mixed control solution and negative sample solution
1—橙皮苷；2—白花前胡甲素；3—白花前胡乙素
從圖1中可以看出，各色譜峰分離度良好，陰性樣品溶液在白花前胡甲素、白花前胡乙素和橙皮苷對照品相應色譜峰位置未檢出色譜峰。表明本方法系統適用性及專屬性均良好。
2.6 線性關系及檢出限
分別精密吸取混合對照品溶液1、2、3、5、8 μL，在1.2色譜條件下進行測定，以進樣質量(x)為橫坐標、色譜峰面積(y)為縱坐標，繪制標準工作曲線，得到線性方程。將混合對照品溶液進行適當稀釋，以3倍信噪比對應的質量濃度作為檢出限，10倍信噪比對應的質量濃度作為定量限。3種成分質量濃度的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限見表4。
表4 3種成分的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限
Tab. 4 Linear range，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantitation limit of the three components
由表4可知，白花前胡甲素、白花前胡乙素和橙皮苷3種成分的質量在各自范圍內與色譜峰面積線性關系良好，相關系數均不小于0.999 5。
2.7 精密度試驗
取同一批號除痰止嗽丸樣品6份(批號為20010706)，按1.3.2制備樣品溶液，在1.2色譜條件下進樣測定，計算6份樣品中待測成分的色譜峰面積平均值和相對標準偏差(RSD)，結果見表5。
表5 精密度試驗結果
Tab. 5 Results of precision test
由表5可知，白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷峰面積的RSD分別為0.99%，1.05%，1.01% (n=6)，表明方法具有良好的精密度。
2.8 穩定性試驗
取新制備的一批樣品溶液(批號為20010706)，于第0、2、4、6、8、10、12、24 h內在1.2色譜條件下進行穩定性試驗，記錄各組分色譜峰面積，穩定性試驗結果見表6。
表6 穩定性試驗結果
Tab. 6 Results of stability test
由表6可知，白花前胡甲素、白花前胡乙素和橙皮苷峰面積的RSD分別為0.33%、0.42%、0.52%，表明溶液穩定性在24 h內良好。
2.9 加標回收試驗
精密稱取各成分含量已知的同一批次樣品(批號為20010706)，加入混合對照品溶液10 mL，按1.3.2方法，平行處理6份樣品溶液，在1.2色譜條件下分別進行測定，計算加標回收率，結果見表7。
表7 加標回收試驗結果
Tab. 7 Results of addition recovery test
由表7可知，白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷的平均回收率分別96.90%、102.98%、101.75%，表明該方法具有較高的準確度。
3. 結語
建立了高效液相法同時測定除痰止嗽丸中白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷3種成分含量，對色譜條件、樣品處理條件等進行了優化。該方法操作便捷，專屬性良好，精密度、穩定性、準確度均較高，可適用于除痰止嗽丸中3種成分含量的同時測定，為除痰止嗽丸的質量控制提供方法學參考。
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來源：化學分析計量
