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一、背景及原理

自1981年首次發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）以來，慢病毒的載體化研究迅速展開。慢病毒（Lentivirus）載體是通過對HIV-1進行改造而得到的，其采用了VSVG外殼，這使得慢病毒能夠感染更多類型的細胞，包括分裂期和非分裂期細胞、干細胞以及原代培養(yǎng)的細胞。這種特性使得慢病毒能夠在宿主細胞中實現(xiàn)較長期的外源基因表達，并且具有較高的安全性。因此，慢病毒成為了一種穩(wěn)定表達外源基因、感染譜廣泛的有效工具，在基因過表達、RNA干擾、miRNA研究等領域得到了廣泛應用，為研究啟動子調控、基因的過表達或者沉默等提供了有力支持。

其原理首先是將所需基因組整合到慢病毒載體中，然后將該載體轉染至攜帶包裝蛋白的細胞中。細胞內(nèi)表達的包裝蛋白能夠與慢病毒載體結合，將外源基因組包裝成慢病毒顆粒。最終，這些顆粒能夠感染其他細胞，并釋放外源基因組，實現(xiàn)基因傳遞和轉移。

二、實驗步驟

以貼壁細胞為例：

1）準備細胞

首先在24孔培養(yǎng)板中接種適量的目標細胞和平行對照293T細胞，確保它們處于對數(shù)生長期。由于不同細胞的生長速度不同，接種數(shù)量會有所不同，但一般會保證在第二天進行病毒感染時細胞的匯合率在30%-50%之間。然后將培養(yǎng)板放入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

2）感染病毒

對于-80℃凍存的病毒，將其在冰上融化后使用。接著將目標細胞取出培養(yǎng)箱，觀察其生長狀態(tài)，只有當細胞狀態(tài)良好時（因為細胞狀態(tài)會對轉染產(chǎn)生影響），才能開始實驗。

3）換液

通常，在添加病毒液后的24小時內(nèi)，將含有病毒的培養(yǎng)液廢棄，加入新鮮的完全培養(yǎng)液，并繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（具體換液時間可根據(jù)細胞感染后的狀態(tài)進行調整）。如果感染后細胞出現(xiàn)明顯的皺縮或狀態(tài)不佳，建議在4-6小時內(nèi)進行換液；如果感染后細胞狀態(tài)一直良好，也可以延長換液時間至感染后48-72小時。

4）熒光觀察/抗性藥物篩選

在感染病毒48-72小時后，針對帶有GFP報告基因的病毒，可使用熒光顯微鏡觀察GFP熒光強度。對于攜帶Puromycin或其他抗性基因的病毒，可替換含有適當濃度抗生素的完全培養(yǎng)液進行篩選，以篩選出穩(wěn)定表達的細胞株。

5) 穩(wěn)定細胞株篩選

將Puromycin篩選后的細胞進行傳代，并繼續(xù)持續(xù)加入合適濃度Puromycin維持抗性，連續(xù)篩選并傳3代后，凍存保存穩(wěn)定表達細胞株。后續(xù)可通過Western blot或qPCR實驗驗證。

6）篩單克隆

在單克隆細胞培養(yǎng)中，首先將細胞均勻分布至96孔板，待其生長至80%融合后進行消化處理。隨后，逐級將細胞傳代至48、24、12、6孔板，最終過渡至6厘米培養(yǎng)皿，以確保單克隆的分離和純化。然而，并非所有細胞都能成功生長，因此在實際操作中，通常需要一至兩個月的時間才能取得期望的實驗成果。

在接種后的幾天里，每天都要觀察細胞的生長情況。對于帶有熒光標記的慢病毒，確保細胞株中的每個細胞都表現(xiàn)出100%的熒光，并進行適當標記。同時，定期更換培養(yǎng)液（含有抗生素），以維持培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。篩選結束后，與之前相同的步驟，對細胞進行qPCR或Western Blot鑒定。鑒定結果正常的單克隆細胞將被凍存保種，并進行復檢。

三、注意事項

1）在進行病毒操作時，最好在生物安全柜內(nèi)進行。如果只能使用普通超凈工作臺操作病毒，請不要打開排風扇，以防止病毒擴散。在進行病毒操作時，請務必穿戴實驗服、口罩和手套，以保護自己免受病毒的可能感染。

2) 慢病毒的儲存條件及期限為：在-80攝氏度條件下可保存12個月，在4攝氏度條件下可保存一周。若需多次使用，建議將慢病毒分裝后存放于-80攝氏度，并盡量避免反復凍融。反復凍融會導致病毒滴度下降，因此在使用過程中應盡量避免這種情況的發(fā)生。

3）細胞密度在慢病毒感染后的一段時間內(nèi)可能會受到限制，因此通常建議將細胞密度設定為傳代密度的1到2倍。然而，應避免使細胞融合度超過90%，以確保慢病毒的充分利用。

4）Polybrene在細胞培養(yǎng)中的主要作用是提高逆轉錄病毒感染細胞的效率。Puromycin的標準終濃度范圍為1-10μg/mL，不同細胞系對Puromycin的工作濃度可能有所不同，可查閱文獻或進行預實驗以確定最佳Puromycin篩選濃度。

5）如果添加Puromycin后出現(xiàn)大量細胞死亡，需要及時換液，以防止死細胞釋放的有害物質對具有抗性的細胞的生長產(chǎn)生不利影響。