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嘉峪檢測網 2025-03-18 18:04
本研究旨在消除 0.5% 左氧氟沙星滴眼液的抗菌活性，并開發一種用于 0.5% 左氧氟沙星滴眼液的微生物計數方法，以評估該滴眼液樣品的微生物計數方法的適用性。研究方法包括采用聚偏二氟乙烯（PVDF）無菌濾膜對 0.5% 左氧氟沙星滴眼液供試液進行薄膜過濾，隨后用 500 mL pH 7.0 的無菌氯化鈉 -蛋白胨緩沖液進行沖洗，每次沖洗液用量為 50 mL。在最后一次沖洗液中加入金黃色葡萄球菌菌液，進行過濾、貼膜和培養計數。研究結論表明，通過使用聚偏二氟乙烯（PVDF）無菌濾膜過濾 0.5% 左氧氟沙星滴眼液供試液，可獲得較高的微生物回收率（111%），有效消除了 0.5% 左氧氟沙星滴眼液的抗菌活性。因此，該方法適用于 0.5% 左氧氟沙星滴眼液的微生物計數方法適用性試驗。
1.引 言
0.5% 左氧氟沙星滴眼液是一種廣譜抗菌滴眼液。左氧氟沙星的化學式為 C18H20FN3O4，屬于喹諾酮類藥物，在水中微溶。體外試驗表明，左氧氟沙星對多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌展現出顯著的抗菌活性。具體而言，它對葡萄球菌屬、鏈球菌屬（包括肺炎球菌）、細球菌屬、腸球菌屬、棒狀桿菌屬等革蘭陽性菌，以及假單胞菌屬（包括綠膿桿菌）、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌屬、沙雷氏菌屬、克雷白氏菌屬、變形桿菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬等革蘭陰性菌均具有較強的抗菌作用。
根據《中國藥典》四部 1105 表 2，針對常見干擾物的中和劑或滅活方法，喹諾酮類抗生素的中和劑可選用鎂或鈣離子[1]。龍慧 [2] 等人在進行鹽酸左氧氟沙星片微生物限度檢查法的方法學研究時，選用硫酸鎂作為中和劑，以進行鹽酸左氧氟沙星片的微生物測試。萬進 [3] 等人在進行鹽酸左氧氟沙星凝膠微生物限度檢查方法驗證時，采用鈣離子（Ca2+）來中和喹諾酮類抗菌藥物的抗菌活性。舒靜 [4] 等人在進行鹽酸左氧氟沙星膠囊微生物限度檢查方法學驗證時，聯合使用離心沉淀集菌法、薄膜過濾法及中和法，以去除鹽酸左氧氟沙星膠囊的抑菌活性。孫偉 [5] 等人以 β 環糊精作為中和劑，采用薄膜過濾法對喹諾酮類抗生素藥品進行微生物限度方法學研究。
上述研究均采用中和劑來消除左氧氟沙星的抗菌活性，但中和劑的配置過程較為復雜，且在方法適用性試驗中需要增設中和劑對照組，這使得方法適用性試驗和后續供試品的測試操作較為復雜，增加了工作量。本文提出了一種新的試驗方法，通過將常用的混合纖微素膜（MCE）無菌濾膜更換為聚偏二氟乙烯（PVDF）無菌濾膜，有效消除了左氧氟沙星的抗菌活性。該方法操作簡便，試驗結果良好，不僅提升了試驗效率，還減少了因操作步驟復雜可能導致的微生物污染風險。
2.消除抑菌活性的方法
在微生物測試方法適用性試驗中，供試品的抑菌活性是一個難點。目前，常用的消除抗菌活性的方法包括稀釋法、薄膜過濾法、化學中和法和離心沉淀法。對于抑菌性較強的供試品，可以聯合使用上述方法以更有效地去除抗菌活性。為便于比較，表1 匯總了各消除抗菌活性方法的特點。
表1 抗菌活性的去除或滅活
3.試驗程序
本部分將詳細介紹進行試驗的具體步驟和方法，以確保試驗的準確性和可重復性。下文會提供一系列的指導原則和操作流程，幫助實驗者理解并遵循正確的試驗程序，從而獲得穩定和一致的試驗結果。
3.1樣品信息
在試驗開始之前，需要對樣品進行詳細的記錄和分類，包括樣品的來源、類型、名稱等關鍵信息，如表2所示。這些信息為試驗的順利進行提供了有力的數據支持。
表2 樣品信息
3.2試驗儀器和材料
在進行科學試驗或技術測試時，選擇恰當的試驗儀器和材料至關重要。試驗儀器涵蓋了各種精密測量設備、分析儀器等，它們對于準確獲取試驗數據、確保試驗結果的可靠性和可重復性起著決定性作用。同時，試驗材料的選擇也極為重要。試驗材料包括試驗過程中使用的試劑、樣品、耗材等，其純度、穩定性和一致性直接關系到試驗的準確性和有效性。關于主要設備、耗材、培養基和試劑、試驗菌株的詳細信息，請參見表3、表4、表5和表6。
表3 主要設備
表4 耗材
表5 培養基和試劑
表6 試驗菌株
3.3方法開發試驗
3.3.1 試驗步驟
取 1 mL 0.5% 左氧氟沙星滴眼液樣品，轉移至 9 mL pH 7.0 無菌氯化鈉 -蛋白胨緩沖液中，充分混勻，制備成1:10 的供試品溶液。
首先，使用適量的沖洗液對過濾器的濾膜進行預沖洗，確保濾膜充分潤濕。隨后，將上述制備好的 1:10 供試品溶液進行過濾。用 1000 mL pH 7.0無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗液用量為 50 mL。在最后一次沖洗中加入 102 ～ 103 CFU/mL 的金黃色葡萄球菌菌液 100 μL ，繼續過濾。過濾完成后，將濾膜貼到 TSA 平板上，將平板倒置于 30 ～ 35 ℃的環境中培養，時間不超過 3 天。
3.3.2 不同試驗條件的對比
使用不同濃度的含中和劑的 pH7.0 無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液、含中和劑的 TSA 平板、MCE 無菌濾膜和PVDF 無菌濾膜，按照上述步驟進行試驗。具體的試驗組合方式和試驗結果詳見表7 和表8。
由表7 和表8 可知，使用含 0.1 mol/L硫酸鎂中和劑的 pH 7.0 無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液和含 0.1 mol/L 硫酸鎂中和劑的 TSA 平板，并未能有效去除 0.5% 左氧氟沙星滴眼液的抗菌活性。然而，將 MCE 無菌濾膜更換 為 PVDF 無菌濾膜后，試驗結果顯示出明顯的差異；在不使用硫酸鎂中和劑的情況下，僅通過將濾膜由MCE 無菌濾膜更換為 PVDF 無菌濾膜，0.5% 左氧氟沙星滴眼液的抗菌活性得到了有效去除，且微生物生長狀況優于使用硫酸鎂中和劑的試驗組。
表7 方法開發試驗1組
表8 方法開發試驗2組
常規供試品薄膜過濾通常選用混合纖微素膜（MCE）無菌濾膜。MCE濾膜由硝酸纖維素和醋酸纖維素制成，具有孔隙率高，孔徑分布均勻，微孔阻力小，截留效果好，濾速快等特點，廣泛應用于分析和研究領域。然而，MCE 無菌濾膜不耐有機液體和強酸堿溶液。
聚偏二氟乙烯（PVDF）無菌濾膜具備諸多優異性能：高機械強度和韌性、抗真菌性、高耐磨性、高滲透性、良好的熱穩定性和阻燃性，以及耐化學腐蝕性和抗氧化性。此外，它還具有最低的蛋白吸附和優秀的化學兼容性，確保了結構的完整性。
使用 MCE 無菌濾膜時，0.5% 左氧氟沙星滴眼液中的左氧氟沙星無法被完全過濾，會在濾膜中殘留，從而抑制微生物的生長。而 PVDF 無菌濾膜具有較低的吸附性，能夠有效地過濾供試品溶液中的左氧氟沙星抑菌劑，消除左氧氟沙星的抑菌性能，使得微生物能夠良好生長。
3.4試驗步驟
3.4.1 試驗組
取 1 mL 0.5% 左氧氟沙星滴眼液樣品，轉移至 9 mL pH 7.0 無菌氯化鈉 -蛋白胨緩沖液中，充分混勻，制備成1:10 的供試品溶液。
首先，使用適量的沖洗液對過濾器的濾膜進行預沖洗，確保濾膜充分潤濕。隨后，將上述 1:10 的供試品溶液進行過濾。接著，依次使用 500 mL、800 mL、1000 mL pH 7.0 的無菌氯化鈉 -蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗液用量為 50 mL。在最后一次沖洗液中加入102 ～ 103 CFU/mL 的金黃色葡萄球菌菌液 100 μL ，繼續過濾。過濾完成后，將濾膜貼到 TSA 平板上。
3.4.2 供試品對照組
取 1 mL 0.5% 左氧氟沙星滴眼液樣品，轉移至 9 mL pH 7.0 無菌氯化鈉 -蛋白胨緩沖液中，充分混勻，制備成1:10 的供試品溶液。
首先，使用適量的沖洗液對過濾器的濾膜進行預沖洗，確保濾膜充分潤濕。隨后，將上述 1:10 的供試品溶液進行過濾。接著，依次使用 500 mL、800 mL、1000 mL pH 7.0 的無菌氯化鈉 -蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗液用量為 50 mL。在最后一次沖洗液中加入 pH 7.0 無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液100 μL，繼續過濾。過濾完成后，將濾膜貼到 TSA 平板上。
3.4.3 菌液對照組
取 1 mL pH 7.0 的無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液加入至 9 mL pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，充分混勻，制得 1:10 的樣品溶液。
首先，使用適量的沖洗液對過濾器的濾膜進行預沖洗，確保濾膜充分潤濕。隨后，過濾上述制備的樣品溶液。接著，分別用500 mL、800 mL、1000 mL pH 7.0的無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗液用量為 50 mL。在最后一次沖洗液中加 102 ～ 103 CFU/ml 的金黃色葡萄球菌菌液 100 μL，然后進行過濾。過濾結束后，將濾膜貼到 TSA平板上。
3.4.4 陰性對照組
取 1 mL pH 7.0 的無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液加入至 9 mL pH7.0 的無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液中，充分混勻，制得 1:10 的樣品溶液。
首先，使用適量的沖洗液對過濾器的濾膜進行預沖洗，確保濾膜成分潤濕。隨后，過濾上述制備的樣品溶液。接著，用 1000 mL pH 7.0 的無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液分次對濾膜進行沖洗，每次沖洗液用量為 50 mL。過濾結束后，將濾膜貼到 TSA 平板上。
3.4.5 培養
貼膜后的 TSA 平板應倒置于30 ～ 35℃的培養環境中，時間不超過3 天。
3.4.6 結果解釋
在試驗中，試驗組的回收率在50% ～ 200% 的范圍內，且陰性對照組無菌生長。回收率計算公式為：
3.5數據結果和分析
根據上述試驗數據，使用 PVDF 無菌濾膜薄膜過濾，并分別采用 500 mL、800 mL 和 1000 mL pH 7.0 的無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液進行沖洗，每次沖洗液用量為 50 mL。在最后一次沖洗液中加入金黃色葡萄球菌菌液，能夠獲得較高的微生物回收率，有效地消除了 0.5%左氧氟沙星滴眼液的抑菌性。試驗結果（見表9）顯示，使用 500 mL pH 7.0 的無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液沖洗時，微生物回收率為 111%，符合試驗組回收率在 50% ～ 200% 范圍內的要求。考慮到盡量減少沖洗量以降低對微生物生長的潛在影響，最終選擇 500 mL pH 7.0的無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液作為 0.5%左氧氟沙星滴眼液微生物計數法的沖洗量，以進行方法適用性試驗。
表9 試驗數據結果和分析
4.結 論
使用 PVDF 無菌濾膜薄膜過濾，配合 500 mL pH 7.0 的無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液沖洗，每次沖洗液用量為50 mL，在最后一次沖洗液中加入金黃色葡萄球菌菌液進行過濾。過濾結束后，將濾膜貼到 TSA 平板上進行倒置培養和計數。此方法能夠獲得較高的微生物回收率（111%），有效地消除 0.5% 左氧氟沙星滴眼液的抗菌活性，因此該方法適用于 0.5% 左氧氟沙星滴眼液的微生物計數方法適用性試驗。
參考文獻
[1] 國家藥典委員會 . 中國藥典 2020年版·二部 [Z]，2020.
[2] 龍慧，吳鑫，鄢雷娜，陳芳 . 鹽酸左氧氟沙星片微生物限度檢查法的方法學研究 [J]. 中國藥房，2014 年.
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[5] 孫偉，劉文杰，崔穎，牛振東，高 春 .β- 環糊精在喹諾酮類抗生素藥品微生物限度檢查方法建立中的應用 [J]. 藥物分析雜志，2013.
本文作者劉曉嬋，江蘇艾蘇萊生物科技有限公司，僅供交流學習。
來源：制藥工藝與裝備
