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大多數(shù)小分子藥物是酸性或堿性化合物，它們常常帶有各種官能團(tuán)，如羥基、胺類(lèi)、磺酸、 吡啶、咪唑等。對(duì)于這些可解離化合物在反相色譜中的保留與流動(dòng)相的PH值有著密切的關(guān)系。如何正確選擇流動(dòng)相pH在藥物反相色譜分析方法開(kāi)發(fā)中非常關(guān)鍵，可幫助分析人員減少試錯(cuò)時(shí)間和物質(zhì)成本，從而提高工作效率。

01、幾個(gè)基本概念

緩沖溶液

緩沖溶液指的是指由弱酸及鹽、弱堿及其鹽組成的混合溶液，能在一定程度上抵消、減輕外加強(qiáng)酸或強(qiáng)堿對(duì)溶液酸堿度的影響，從而保持溶液的PH值相對(duì)穩(wěn)定。

緩沖容量

緩沖容量是指使單位體積緩沖溶液的PH改變1個(gè)單位時(shí)，所需加入的強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的物質(zhì)的量。是衡量緩沖溶液緩沖能力大小的尺度。單位mol/L pH或mmol/L pH。

pH

氫離子濃度指數(shù)（hydrogen ion concentration）是指溶液中氫離子的總數(shù)和總物質(zhì)的量的比。

pKa

酸度系數(shù)以符號(hào)pKa來(lái)表示：當(dāng)溶液中藥物離子濃度和非離子濃度完全相等，即各占50%時(shí)，溶液的PH值稱(chēng)為該藥的解離常數(shù)（pKa）。

一般來(lái)說(shuō)，較大的Ka值（或較小的pKa值）代表專(zhuān)較強(qiáng)的酸，屬這是由于在同一的濃度下，離解的能力較強(qiáng)。

利用酸度系數(shù)，可以容易的計(jì)算酸的濃度、共軛堿、質(zhì)子及氫氧離子。如一種酸是部分中和，Ka值是可以用來(lái)計(jì)算出緩沖溶液的pH值。

02、如何選擇緩沖液pH值

在選擇緩沖液pH值之前，應(yīng)先了解被分析物的pKa，高于或低于pKa兩個(gè)單位的值，有助于獲得良好的峰形，溶液pH值高于或低于兩個(gè)pKa單位，化合物99%以一種形式存在，才能獲得好的尖銳的峰。

（一）考察離子化合物的pKa值

在反相色譜分析中通常不要求化合物精確的pKa值，我們可以通過(guò)查閱文獻(xiàn)或者根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)按照下圖中列出的主要酸堿官能團(tuán)在水溶液的pKa值進(jìn)行推測(cè)。

注意：按照上表中官能團(tuán)進(jìn)行估算時(shí)分子中相鄰基團(tuán)的不同會(huì)導(dǎo)致pKa出現(xiàn)1~2個(gè)單位的差異。對(duì)于酸性化合物，當(dāng)含有吸電子基團(tuán)時(shí)會(huì)導(dǎo)致酸性增強(qiáng)，pKa值相應(yīng)降低；對(duì)于堿性化合物，當(dāng)含有吸電子基團(tuán)時(shí)會(huì)導(dǎo)致堿性降低，pKa值相應(yīng)降低。

（二）根據(jù)化合物pKa值推測(cè)流動(dòng)相相應(yīng)使用的pH

先看下流動(dòng)相pH對(duì)酸堿化合物的影響：

1. 流動(dòng)相pH對(duì)不同pKa化合物的保留時(shí)間的影響

根據(jù)這幅圖，我們可以看出，當(dāng)流動(dòng)相的pH約等于化合物的pKa時(shí)，可以最大限度的調(diào)整化合物的保留時(shí)間。此時(shí)改變0.1個(gè)單位的pH可以使得保留因子k變化10%，可引起分離度±2.5個(gè)單位的變動(dòng)。但此時(shí)需要進(jìn)行精確控制流動(dòng)相的pH，這要求把流動(dòng)相pH控制在0.02個(gè)單位以內(nèi)，在實(shí)驗(yàn)室很難控制，重現(xiàn)性較差，成為分析的瓶頸。

但我們實(shí)驗(yàn)時(shí)可以將pH范圍放寬，只要將流動(dòng)相pH控制在化合物pKa值±1.5個(gè)單位的范圍內(nèi)（上圖所示的II范圍內(nèi)）就可以對(duì)化合物保留行為產(chǎn)生比較明顯的影響，此時(shí)進(jìn)行分離選擇性較好。同時(shí)為了更好地控制保留行為的重現(xiàn)性，需要控制緩沖液的pH在±0.1個(gè)單位以內(nèi)（當(dāng)流動(dòng)相pH控制范圍較窄時(shí)建議使用緩沖鹽的質(zhì)量進(jìn)行控制，比pH計(jì)進(jìn)行控制效果更優(yōu)）。

通過(guò)以上三點(diǎn)分析我們可以得出，待分析化合物的pKa與確定流動(dòng)相的pH有很大的關(guān)系。主要依據(jù)化合物出峰時(shí)間、化合物的峰型及所需要分離目標(biāo)的化合物綜合考慮來(lái)確定流動(dòng)相的pH。

可能有的實(shí)驗(yàn)人員會(huì)發(fā)現(xiàn)第二點(diǎn)和第三點(diǎn)是有些矛盾的，這時(shí)候就需要對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步的探索，看看是否pH值會(huì)對(duì)化合物的峰型產(chǎn)生影響（有的專(zhuān)家認(rèn)為該觀點(diǎn)缺乏理論和實(shí)踐的支持）或者是否需要準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH在化合物pKa±1.5范圍內(nèi)進(jìn)行提高選擇性。

在實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)有的物質(zhì)會(huì)因稀釋液pH使用不當(dāng)產(chǎn)生峰分叉的現(xiàn)象，調(diào)節(jié)稀釋液的pH即可解決峰的分叉；有時(shí)流動(dòng)相pH在化合物的pKa±2的范圍內(nèi)時(shí)離子化合物并沒(méi)有出現(xiàn)峰分叉、峰型不好現(xiàn)象。

（三）根據(jù)流動(dòng)相pH值選擇所需要的緩沖鹽

緩沖液選擇主要依據(jù)：

1、緩沖溶液的pKa和緩沖容量

一般緩沖溶液的pKa值與流動(dòng)相的pH相等時(shí)緩沖能力最大，pKa與流動(dòng)相的pH相差越大，緩沖液的緩沖能力越差。一般要求流動(dòng)相的pH與緩沖液的pKa值不能超過(guò)±1.0個(gè)單位，當(dāng)緩沖溶液濃度較高時(shí)可以放寬范圍到1.5個(gè)單位。常用的緩沖液的緩沖范圍見(jiàn)下圖：

緩沖溶液的濃度一般在5-50mmol/L，因過(guò)低導(dǎo)致緩沖能力不足（可通過(guò)調(diào)整進(jìn)樣體積查看化合物峰型的變化，如果出現(xiàn)拖尾或者前沿現(xiàn)象，說(shuō)明緩沖溶液的能力不足）；緩沖液濃度過(guò)大會(huì)導(dǎo)致與有機(jī)相混溶時(shí)鹽的析出，對(duì)儀器、色譜柱都會(huì)產(chǎn)生損傷，而且使得基線不好。

2、溶解度

在酸性緩沖溶液中，如磷酸鹽，緩沖液溶解度順序：鈉鹽＜鉀鹽＜銨鹽；有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH=7時(shí)10mmol/L的磷酸鉀在85%甲醇或者75%乙腈中可以溶解，在pH=3時(shí)，在85%甲醇或者85%乙腈中可以完全溶解（此測(cè)試通過(guò)使用容器將不同比例的混合溶劑進(jìn)行混合，觀察大約30min，是否有沉淀產(chǎn)生，否則就要降低緩沖液的濃度或者有機(jī)相的含量，在梯度洗脫時(shí)尤為注意）。

3、紫外吸收

在pH≤3.5，6.0≤pH≤8.5或者pH≥11.0磷酸鹽緩沖液是不錯(cuò)的選擇。而甲酸鹽和乙酸鹽緩沖液的范圍是2.5～6.0，適用于210納米或者更高吸收的檢測(cè)波長(zhǎng)。

緩沖鹽的種類(lèi)或者濃度對(duì)選擇性的改變會(huì)很小，只是起到緩沖作用，提高化合物的保留時(shí)間的穩(wěn)定性。在高效液相色譜法中，分離酸或堿緩沖溶液對(duì)維持流動(dòng)相恒定pH和提高保留時(shí)間的重現(xiàn)性都非常重要。

選擇合適的緩沖鹽需要考慮pKa和緩沖容量、溶解度、紫外吸光度（使用UV檢測(cè)器）、揮發(fā)性（MS蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）、離子對(duì)性質(zhì)、穩(wěn)定性和儀器的兼容性。流動(dòng)相緩沖容量取決于緩沖鹽的pKa，緩沖鹽濃度，流動(dòng)相pH。當(dāng)緩沖液中溶質(zhì)的的兩種形態(tài)（HA和 A-）濃度相等時(shí)，即緩沖鹽的pKa與流動(dòng)相pH相等時(shí)，緩沖能力最大。當(dāng)流動(dòng)相的pH與緩沖鹽的pKa相差越大，緩沖鹽的緩沖容量就越小。因此緩沖的pKa與流動(dòng)相的pH相差不能超過(guò)±1.0個(gè)單位。

流動(dòng)相的緩沖容量一般與緩沖液濃度成正比關(guān)系，通常濃度范圍5~25mmol/L。樣品溶解在流動(dòng)相中可以避免在反相色譜過(guò)程中發(fā)生緩沖能力的問(wèn)題，尤其是流動(dòng)相緩沖液濃度較低或注入樣品量較大的時(shí)候。

當(dāng)緩沖容量偏低時(shí)，可以從以下方面調(diào)節(jié)緩沖容量：