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色譜峰問(wèn)題

色譜峰的問(wèn)題，如色譜峰分離度差、色譜峰過(guò)寬、色譜峰分叉、色譜峰拖尾或前沿以及鬼峰等，通常是由色譜柱及其與流動(dòng)相和樣品/稀釋劑的相互作用引起的。

色譜圖中無(wú)峰：原因有很多，包括進(jìn)樣器沒(méi)有進(jìn)樣、泵沒(méi)有提供相應(yīng)的流量、漏液嚴(yán)重、檢測(cè)器死機(jī)、數(shù)據(jù)系統(tǒng)接線錯(cuò)誤、流動(dòng)相不正確、色譜柱保留性或吸附性特別差或樣品不正確。診斷此類問(wèn)題的最佳程序是回到參考測(cè)試條件（通俗來(lái)說(shuō)，就是之前好的且穩(wěn)定的儀器條件）。如果可以成功復(fù)制參考條件，從而推斷出系統(tǒng)運(yùn)行正常，那么就可以針對(duì)具體的應(yīng)用條件（色譜柱、流動(dòng)相、樣品等）進(jìn)行故障診斷。

色譜峰過(guò)寬或分裂：異常寬的峰和分裂峰是色譜柱性能下降的表現(xiàn)，其原因是樣品污染、部分入口篩板堵塞或色譜柱的柱效嚴(yán)重下降（圖 1 和 2）。

圖 1.可能由色譜柱空洞引起的色譜峰分裂示例。

圖 2. 因暴露于高 pH 值流動(dòng)相而導(dǎo)致：性能良好的 C18 硅膠色譜柱和性能不佳的 C18 硅膠色譜柱的色譜圖對(duì)比。

可通過(guò)反向沖洗色譜柱、在色譜柱入口處重新填充填料或更換色譜柱（現(xiàn)在更常見(jiàn)的方法是更換色譜柱）來(lái)解決這些問(wèn)題。請(qǐng)注意，早期洗脫峰的色譜峰比預(yù)期的要寬，這通常是由于高效液相色譜系統(tǒng)的柱外譜帶展寬造成的（圖 3）。對(duì)于小內(nèi)徑的超高效液相色譜柱而言，這些柱外展寬效應(yīng)尤其有害。

圖 3.  儀器譜帶展寬的影響示例，表明早期洗脫峰受到的影響更大。

若樣品溶液的溶劑強(qiáng)度大于流動(dòng)相強(qiáng)度也會(huì)導(dǎo)致峰形異常（圖 4）。如果可能，用于溶解樣品的稀釋劑的強(qiáng)度應(yīng)與流動(dòng)相 A (MPA) 或梯度分析中的初始流動(dòng)相相同或更弱。如果必須使用強(qiáng)度較高的溶劑作為最終樣品稀釋劑，則應(yīng)保持較小的進(jìn)樣體積（例如 HPLC 中 <2 ~ 5 μl），以防止早期洗脫峰的峰寬變寬或峰分裂。當(dāng)樣品的 pH 值與流動(dòng)相的 pH 值完全不同時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致峰分裂。

圖 4. 用弱于和強(qiáng)于流動(dòng)相強(qiáng)度的不同稀釋劑注入同一樣品溶液時(shí)出現(xiàn)的色譜峰異常示例。

倒峰：色譜圖中的倒峰或凹陷常見(jiàn)于溶劑前沿附近。它們是由折射率變化或吸光度低于流動(dòng)相的樣品溶劑引起的。在溶劑前沿之后開始積分，通常可以忽略這些基線擾動(dòng)。如果所有峰都是倒峰的，則可能是檢測(cè)器導(dǎo)線連接的極性錯(cuò)誤，除非使用間接紫外檢測(cè)技術(shù)。在使用 RI 檢測(cè)器時(shí)，倒峰更為常見(jiàn)。

鬼峰和額外峰：與空白梯度分析（僅注入樣品溶劑進(jìn)行梯度分析）相關(guān)的鬼峰通常是由較弱的流動(dòng)相 (MPA) 中的痕量污染物造成的。通過(guò)使用純化試劑和采取嚴(yán)格的流動(dòng)相制備預(yù)防措施，可將這種情況降至最低。意外的額外色譜峰，特別是那些異常寬的色譜峰，通常是由等度分析過(guò)程中先前進(jìn)樣的后期洗脫色譜峰造成的（圖 5）。其中一些峰可能非常寬，以至于經(jīng)常被誤認(rèn)為是基線漂移。

圖 5. 上一次進(jìn)樣中的高保留峰洗脫造成意外寬峰的示例。

數(shù)據(jù)性能問(wèn)題

精度差和結(jié)果不準(zhǔn)確等數(shù)據(jù)性能問(wèn)題可能很難診斷。數(shù)據(jù)問(wèn)題可能源于系統(tǒng)故障或與流動(dòng)相、方法校準(zhǔn)或樣品制備有關(guān)的問(wèn)題。幾篇已發(fā)表的文章（見(jiàn)文末）介紹了保留時(shí)間和峰面積的系統(tǒng)精度差及其可能的原因和補(bǔ)救措施。色譜法準(zhǔn)確度差的原因可能是色譜峰共洗脫（色譜峰純度）、樣品穩(wěn)定性、樣品制備/回收問(wèn)題、基質(zhì)干擾、設(shè)備校準(zhǔn)或積分問(wèn)題（圖 6）。

圖 6.各種色譜峰積分問(wèn)題示例

一個(gè)很好的指導(dǎo)原則是，打印報(bào)告時(shí)一定要顯示色譜峰基線，以檢查峰面積積分是否正確。出現(xiàn)數(shù)據(jù)問(wèn)題時(shí)，通常需要經(jīng)驗(yàn)豐富的從業(yè)人員提供正確的診斷和補(bǔ)救方法。如后期案例所示，應(yīng)通過(guò)消除每個(gè)潛在原因來(lái)進(jìn)一步調(diào)查這些問(wèn)題。