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介孔二氧化硅薄膜已逐漸被用于生物涂層設計。本研究采用油水兩相法，在鈦納米管表面均勻生長出垂直向介孔二氧化硅薄膜（VMSTF）。所構成的大孔-介孔梯度形貌，使鈦表面的物理結構和化學成分與骨組織更加接近。研究發(fā)現(xiàn)該涂層兼具降解快、可載藥、促成骨的功效。這是VMSTF作為骨種植體涂層的首次探索，為相關研究提供了借鑒。

01、研究內容簡介

牙種植修復技術已廣泛地應用于恢復患者牙列缺損或缺失，成為一種常規(guī)的修復方法，但更快更好的骨結合仍是目前臨床種植技術需解決的關鍵問題。種植體表面處理是影響骨結合的一個重要因素，也是目前國內外研究熱點。課題組前期在鈦表面采用酸蝕和陽極氧化技術制備的微米/納米管結構，因其類似骨組織結構的仿生設計而表現(xiàn)出優(yōu)異的促成骨功能。然而，進一步在納米結構基礎上進行介孔結構修飾或將實現(xiàn)更理想的骨仿生效果，值得探索。介孔硅納米薄膜因其極高的比表面積、易于修飾的內外表面，無毒可降解等特點受到了越來越多的關注。然而在鈦種植體表面制備垂直向介孔硅納米薄膜尚未見文獻報道。傳統(tǒng)的蒸發(fā)誘導自組裝法制備的薄膜始終存在兩大局限：（1）由于硅膠束有水平排列的自發(fā)趨勢，該薄膜內部孔道多為水平走行（Parallel aligned mesoporous silica thin film, PMSTF），導致薄膜與外界的滲透性差。（2）目前鈦基底表面往往會預先進行微納米形貌加工，但這類薄膜厚度較厚，通常會覆蓋整個基底表面，可能會阻礙這些活性形貌作用的發(fā)揮(Fig. 1a)。基于此，本研究創(chuàng)新性地在鈦納米多孔結構表面，采用油水兩相法成功制備出垂直向介孔二氧化硅薄膜（Vertical aligned mesoporous silica thin film, VMSTF）（Fig. 1b）。該薄膜不僅具有直通外界的介孔孔洞（~3 nm），而且可沿納米管（TNT）表面均勻、連續(xù)沉積，構成了復合梯度納米結構。在此基礎上本研究系統(tǒng)觀察和討論了VMSTF@TNT的降解行為、載藥能力和成骨活性（Fig. 1c）。

Fig. 1 The structure comparison between conventional PMSTF (a) and VMSTF (b). The main steps for the preparation of VMSTF@TNT(c).

研究首先采用陽極氧化法，在純鈦表面構筑了大孔級TNT陣列結構（管徑約100 nm）。TNT是已被廣泛研究的，具有內在骨誘導活性的經(jīng)典形貌結構。在此結構基礎上采用油水兩相法，在納米管表面制備垂直向介孔硅薄膜（VMSTF）。通過透射電鏡觀察，可見VMSTF與TNT緊密交聯(lián)，并沿管壁四周均勻沉積，厚度約20 nm。VMSTF沉積過程較為緩和且可控。在2 h時TNT表面首次出現(xiàn)介孔結構，此后VMSTF主要在管內沉積，直至24 h后徹底填滿管腔而轉變?yōu)楣芡獬练e（Fig. 2）。

Fig. 2 FE-TEM (a, b), STEM (inset) and growing process observations (c) of  VMSTF on TNT.

研究者接著在模擬生理環(huán)境下（PBS，37℃），觀察到了VMSTF的高速降解性。結果顯示：介孔形貌2 h后基本消失，24 h后薄膜基本降解完全，最終硅離子釋放總量約為10 ppm（Fig. 3）。VMSTF所表現(xiàn)的小時尺度內的降解速率以及稀少的硅釋放總量，為其生物安全性奠定了基礎。

Fig 3. ICP-AES analysis of the released silicon ion (a) and the FE-SEM observations of VMSTF@TNT after incubation with PBS for 72 h (b). White scale bar=200 nm, yellow scale bar=50 nm.

為了驗證VMSTF的載藥能力，本研究采用地塞米松（DEX）作為模型分子進行了藥物加載/釋放效率實驗。FE-SEM及ATR-FTIR光譜結果證實了TNT，PMSTF，VMSTF@TNT表面均成功負載DEX。但VMSTF的負載量是其余兩組的2.3倍。此外，VMSTF表面藥物雖釋放稍緩，但釋放率未見明顯差異。因此，VMSTF較單純的納米管或傳統(tǒng)的水平介孔硅具有更出色的載藥性能，但若要實現(xiàn)更理想的緩釋或控釋效果可能需要進一步修飾（Fig. 4）。

Fig 4. Drug delivery from different surfaces. (a) DEX loading observation by FE-SEM. White scale bar=200 nm, yellow scale bar=50 nm. (b) ATR-FTIR spectrum of DEX loaded samples and (c, d) their DEX loading/release behaviors. *p< 0.05, **p< 0.01 (vs VMSTF@TNT).

植入物表面的親水性與成骨細胞的早期生物學行為密切相關。VMSTF@TNT表面展現(xiàn)出較強的親水性（Fig. 5a），這可能由于介孔孔洞表面所帶的大量硅羥基引起。為了進一步驗證VMSTF@TNT的體外生物學效果。本研究采用MC3T3-E1細胞進行了一系列體外評價。結果表明：VMSTF@TNT表面細胞早期粘附數(shù)量、細胞活力，成骨分化能力均顯著增強（Fig. 5b-j）。這些結果證實，VMSTF可以在成骨細胞功能的多個階段發(fā)揮積極作用。

Fig 5. Hydrophilicity, cell behaviors and osteogenic differentiation on the surface of three samples. (a) Water contact angle measurements. (b, c) CLSM images showing the attachment and morphology of MC3T3-E1. White scale bar=200 nm, yellow scale bar=50 nm, blue bar=5 μm. (d) Quantification of attached cell counts. (e) Cell viability of MC3T3-E1 as measured by CCK-8. (f) Relative mRNA expression of four osteogenic genes. (g, h) The ALP activity staining and quantification. (i, j) The calcium nodules formation evaluation by Alizarin Red staining and semi-quantification. *p< 0.05, **p< 0.01, ***p< 0.001.

總結：通過油水兩相法制備的垂直向介孔硅薄膜，使鈦表面在大孔級納米管結構基礎上進一步形成了介孔級結構和硅元素的負載，這與骨組織結構和成分更加接近。該結構中，介孔通道與外環(huán)境之間的有效溝通可帶來三個主要的突出優(yōu)勢：1. 降解速度快，可以使效應細胞及時與鈦基底接觸，充分發(fā)揮基底納米管結構的促成骨優(yōu)勢；2. 具備藥物裝載/釋放能力，可用于治療；3. 通過介孔結構與硅元素的釋放可促進成骨細胞粘附和分化，進一步增強納米管的成骨能力。這項工作為生物材料表面涂層設計提供了新的研發(fā)策略，顯示了介孔材料在組織工程中的廣闊應用前景。

該研究得到了國家自然科學基金（81530051/   31800790/ 31670966）、陜西省重點研發(fā)計劃項目(2019SF-031)、丹麥Frie   Forskningsfond 基金(9040-00219B)等項目支持。

原文信息

Zhe Li, Yide He, Lasse Hyldgaard Klausen, Ning Yan, Jing Liu, Fanghao Chen,Wen Song*, Mingdong Dong*, Yumei Zhang*.   

Growing vertical aligned mesoporous silica thin film on nanoporous substrate for enhanced degradation, drug delivery and bioactivity. 

Bioactive Materials 6 (2021) 1452–1463.