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嘉峪檢測網(wǎng) 2021-05-17 13:17
摘要 目的：采用氣相色譜法測定藥用輔料辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯中脂肪酸組成。方法：采用以聚乙二醇-20 mol·L-1為固定液的DB-WAX毛細管柱(30 m×0.53mm×1.0 μm)與氫火焰離子化檢測器(FID)，柱溫初始溫度設(shè)定為70 ℃，保持2 min，以每分鐘5 ℃的速率升溫至230 ℃，維持10 min，進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為250 ℃，分流比為5∶1。結(jié)果：本試驗成功建立了脂肪酸組成的氣相測定方法，經(jīng)方法學(xué)驗證，確定己酸甲酯、辛酸甲酯、癸酸甲酯、月桂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯的檢測限與定量限，且該方法的系統(tǒng)適用性、專屬性、精密度良好，三批試樣各成分均在合理范圍內(nèi)。結(jié)論：本試驗建立的氣相色譜法可用于辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯中脂肪酸組成的測定，可為其質(zhì)量控制與質(zhì)量標準建立提供參考依據(jù)。
關(guān)鍵詞：辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯；脂肪酸組成；氣相色譜法
辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(caprylocaproyl polyoxylglycerides)，又名辛酰己酰聚氧甘油酯，是一種常見的聚乙二醇脂肪酸甘油酯型藥用輔料。作為一種自乳化的非離子型表面活性劑[1]，它可以用作賦形劑、增溶劑、吸收促進劑、潤濕劑、乳劑/微乳中油相穩(wěn)定劑，以及脂溶性藥物在水凝膠中的乳化劑等，因而被廣泛應(yīng)用于口服、局部和透皮給藥系統(tǒng)中。辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯與大多數(shù)活性藥物相容性好，同時能提高藥物的分散穩(wěn)定性。其能夠增加藥物角質(zhì)滲透性，也能改善眼部藥物遞送的滲透性和生物利用度[2]。目前研究較為廣泛的是它可以作為有效的腸滲透促進劑來增加藥物口服生物利用度[1,3]，有用于大分子和BCS Ⅲ類分子口服制劑的應(yīng)用前景。作為親水的分散性油脂型輔料，辛酸癸酸甘油酯還可用于制備水凝膠。
辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯是由甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯、聚乙二醇(平均分子量200-400)單酯和二酯組成的混合物[5]。一般而言，它可由三種途徑制得：(1)由中鏈甘油三酯經(jīng)聚乙二醇(PEG)部分醇解而得；(2)甘油和聚乙二醇與辛酸和癸酸酯化而得；(3)甘油酯和環(huán)氧乙烷與辛酸及癸酸縮聚而得。
藥用輔料通常在制劑中占有較大的比重，因而輔料的質(zhì)量直接影響制劑的安全性與有效性[6]。脂肪酸的組成是影響辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯質(zhì)量的重要指標，不同脂肪酸組成可能會影響其應(yīng)用性能及其穩(wěn)定性，甚至是安全性。在辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯制備過程中，由生產(chǎn)原料可能會帶入己酸、月桂酸及肉豆蔻酸等其他脂肪酸雜質(zhì)。由于脂肪酸本身的沸點高，高溫條件下易裂解，在分析過程中極易造成損失，從而影響分析結(jié)果。故而脂類物質(zhì)中脂肪酸組成的檢測方法常常使用甲醇與油脂類物質(zhì)進行醇解，在降低沸點的同時提高其穩(wěn)定性，再通過氣相色譜法對甲酯進行分析，從而獲取待測物中脂肪酸的具體組成。將辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯試樣甲酯化后測定主要成分辛酸甲酯、癸酸甲酯及雜質(zhì)己酸甲酯、月桂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯的含量，不僅能夠掌握辛酸癸酸甘油酯的結(jié)構(gòu)組成，還可以以此進行質(zhì)量控制，并能夠?qū)χ苽渖a(chǎn)過程各原料的選擇與工藝的優(yōu)化提供依據(jù)。目前，辛酸癸酸甘油酯的質(zhì)量標準暫未收載于《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020年版中，但USP43-NF38、EP 10.0和BP 2019均有收載，脂肪酸組成是其質(zhì)量標準中的重要質(zhì)量參數(shù)。各國藥典所采用的脂肪酸組成測定方法類似，均是通過測定甲酯化后的辛酸甲酯、癸酸甲酯及雜質(zhì)己酸甲酯、月桂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯含量來分別計算各脂肪酸含量組成，因而本文在參考USP43-NF38該品種項下脂肪酸組成的檢測方法基礎(chǔ)上，建立脂肪酸組成檢測方法學(xué)并對收集的樣品進行測定，為后續(xù)研究中建立并完善辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯的質(zhì)量標準，規(guī)范其生產(chǎn)與使用，提供科學(xué)依據(jù)。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
氣相色譜儀(Trace 1300，Trace 1310)配備氫火焰離子化檢測器(FID)及自動進樣器(ThermoFisher Scientific)；氣相色譜柱(Agilent，DB-WAX，30 m×0.53 mm×1.0 μm)；十萬分之一天平(SECURA25-1CN，34491760)；萬分之一電子分析天平(BSA124S，34890390)(Sartorius); 萬分之一分析天平(Mettler Toledo，AL204)
1.2 試劑
己酸甲酯標準品(批號：190138-201501)；月桂酸甲酯標準品(批號：190141-201501)；癸酸甲酯標準品(批號：190140-201501)；辛酸甲酯標準品(批號：190139-201501)；肉豆蔻酸甲酯標準品(批號：190028-201603)均由中國食品藥品檢定研究院提供；氫氧化鈉；甲醇；三氟化硼；無水硫酸鈉；正庚烷(色譜級)；水為超純水；辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯樣品由生產(chǎn)企業(yè)惠贈(批號：162677、165394、157566，分別記為批次A、B、C)。
2 方法與結(jié)果
2.1 溶液的配制
2.1.1 己酸甲酯儲備液
取己酸甲酯標準品適量，精密稱定，用正庚烷溶解稀釋并定容，得到8.081 mg·mL-1己酸甲酯儲備液。
2.1.2 辛酸甲酯儲備液
取辛酸甲酯標準品適量，精密稱定，用正庚烷溶解稀釋并定容，得到8.727 mg·mL-1辛酸甲酯儲備液。
2.1.3 癸酸甲酯儲備液
取癸酸甲酯標準品適量，精密稱定，用正庚烷溶解稀釋并定容，得到8.708 mg·mL-1癸酸甲酯儲備液。
2.1.4 月桂酸甲酯儲備液
取月桂酸甲酯標準品適量，精密稱定，用正庚烷溶解稀釋并定容，得到8.480 mg·mL-1月桂酸甲酯儲備液。
2.1.5 肉豆蔻酸甲酯儲備液
取肉豆蔻酸甲酯標準品適量，精密稱定，用正庚烷溶解稀釋并定容，得到8.160 mg·mL-1肉豆蔻酸甲酯儲備液。
2.1.6 對照品儲備溶液
分別精密移取上述己酸甲酯儲備液619 μL、辛酸甲酯儲備液573 μL、癸酸甲酯儲備液574 μL、月桂酸甲酯儲備液589 μL、肉豆蔻酸甲酯613 μL儲備液于5 mL量瓶中，加正庚烷稀釋定容，配制成含己酸甲酯(1.002 mg·mL-1)、辛酸甲酯(0.994 9 mg·mL-1)、癸酸甲酯(0.992 7 mg·mL-1)、月桂酸甲酯(1.000 6 mg·mL-1)和肉豆蔻酸甲酯(0.996 5 mg·mL-1)的對照品儲備溶液。
2.1.7 對照品溶液
取1.0 mL對照品儲備溶液，置10 mL量瓶中，加正庚烷稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.1.8 供試品溶液
取本品約0.1 g，置于25mL圓底兩口燒瓶中，加20 g·L-1的氫氧化鈉的甲醇溶液2 mL，連接回流裝置搖動并加熱至沸騰30 min。通過冷凝器加入三氟化硼-甲醇溶液2 mL，繼續(xù)煮沸30min。通過冷凝器加入正庚烷5 mL，繼續(xù)煮沸5 min。冷卻后加入飽和氯化鈉溶液10 mL，振搖約15 s，靜置分層，取上層有機層2 mL，用2mL水洗滌3次。經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，作為供試品溶液。
2.2 色譜條件
色譜柱：DB-WAX，以聚乙二醇-20 mol·L-1為固定液的石英毛細管柱(30 m×0.53 mm×1.0 μm)；檢測器：氫火焰離子化檢測器(FID)；載氣：氮氣；進樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：250℃；分流比：5∶1；進樣量：1 μL；色譜柱溫度：初始溫度設(shè)定為70 ℃，保持2min，以每分鐘5 ℃的速率升溫至230 ℃，維持10min。
取對照品儲備溶液、對照品溶液和供試品溶液各1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，按面積歸一化法以峰面積計算各物質(zhì)含量。
3 方法學(xué)建立
3.1 系統(tǒng)適用性
分別取空白溶劑和對照品儲備液、對照品溶液各1 μL，按“2.2”項下的色譜條件注入色譜儀，記錄色譜圖。己酸甲酯、辛酸甲酯、癸酸甲酯、月桂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯間分離度均大于4.0，理論塔板數(shù)按癸酸甲酯計算均大于15 000，符合定量分析要求。在本試驗條件下，己酸甲酯保留時間約為7.715 min，辛酸甲酯保留時間約為13.418 min，癸酸甲酯保留時間約為18.630 min，月桂酸甲酯保留時間約為23.255 min，肉豆蔻酸甲酯保留時間約為27.462 min。
3.2 專屬性試驗
專屬性要求空白溶劑正庚烷對己酸甲酯、辛酸甲酯、癸酸甲酯、月桂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯含量檢測均無干擾。取空白溶劑、對照品溶液、供試品溶液各1 μL，按“2.2”項下的色譜條件注入色譜儀，記錄色譜圖?？瞻兹軇┻M樣時在己酸甲酯、辛酸甲酯、癸酸甲酯、月桂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯保留時間附近均未檢測出峰，不干擾測定，供試品溶液色譜圖中肉蔻酸甲酯未檢出(圖1)。
3.3 檢測限與定量限
將對照品儲備溶液用空白溶劑正庚烷照“2.1”項下溶液配制方法逐級稀釋，制備一系列不同濃度甲酯的對照溶液，精密吸取1 μL，按“2.2”項下色譜條件注入氣相色譜儀，檢測信噪比。以信噪比為3∶1 時的相應(yīng)濃度確定檢測限，以信噪比為10∶1時的相應(yīng)濃度確定定量限。己酸甲酯、辛酸甲酯、癸酸甲酯、月桂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯的檢測限和定量限見表1。
3.4 精密度
精密稱取辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯樣品(A批次，批號為：162677)1.0 g，平行稱定6份，按“2.1”項下供試品溶液配制方法操作，平行配制，分別取1 μL按“2.2”項下的色譜條件注入色譜儀，分別計算己酸甲酯、辛酸甲酯、癸酸甲酯、和月桂酸甲酯的峰面積RSD，分別為0、0.83%、1.1%和0，肉豆蔻酸甲酯未檢出，符合精密度要求，表明方法重復(fù)性良好。
1.己酸甲酯(methylcaproate) 2.辛酸甲酯(methyldecanoate) 3.癸酸甲酯(methyldecanoate) 4.月桂酸甲酯(methyllaurate) 5.肉豆蔻酸甲酯(methylmyristate) A.空白溶劑(blank solvent) B.對照品儲備溶液(reference stock solution) C.對照品溶液(reference solution) D.辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯供試品溶液(sample solution of caprylocaproyl polyoxylglycerides)
圖1 典型色譜圖
Fig.1 Typical chromatograms
3.5 樣品測定
按“2.1.8”項下供試品溶液配制方法，配制三批次供試品溶液，分別取1 μL按“2.2”項下的色譜條件注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，依據(jù)面積歸一化法，按下式計算不同批次辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯中己酸甲酯、辛酸甲酯、癸酸甲酯、月桂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯含量：
含量=100×(A/B)
其中A為各脂肪酸酯單獨的峰面積，B為供試品溶液色譜圖中除了溶劑峰的所有峰面積的總和。
三批次樣品所測得的結(jié)果均與USP43-NF38要求一致，己酸甲酯含量都不高于2.0%，辛酸甲酯與癸酸甲酯的含量分別在50.0%至80.0%、20.0%至50.0%之間，月桂酸甲酯含量都不高于3.0%，肉豆蔻酸甲酯均未檢出。各批次各組分含量見表2。
4 討論與展望
油脂性輔料通常是良好的非離子型表面活性劑，由于其具有卓越的增溶能力和兩親性，能夠有效地增加藥物對角質(zhì)層的穿透性，并促進藥物滲透及擴散，具有廣闊的應(yīng)用前景。但目前類似辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯的許多油脂性輔料尚未被《中國藥典》(2020年版)收載，故而對于產(chǎn)品的質(zhì)量要求和生產(chǎn)規(guī)范缺乏統(tǒng)一的標準，無法評判產(chǎn)品的優(yōu)劣與安全性，嚴重影響到此類輔料的應(yīng)用，亟需規(guī)范完善。對于辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯的脂肪酸組成的控制，USP43-NF38與EP 10.0中對五種脂肪酸的含量進行了規(guī)定[5,7]：主要成分辛酸含量應(yīng)為50.0%至80.0%之間，癸酸含量應(yīng)為20.0%至50.0%之間；雜質(zhì)成分己酸最高含量不超過2.0%，月桂酸最高不應(yīng)超過3.0%，肉豆蔻酸含量最多不應(yīng)該超過1.0%。因此可參照USP43-NF38與EP10.0的相關(guān)方法和規(guī)定來研究辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯的脂肪酸組成。但為了使輔料的標準具有更廣泛的適用性，需在確保使用安全的前提下，兼顧考慮各地地方標準及各個廠家的企業(yè)標準，確立既可以保證產(chǎn)品有效性、安全性，又能具有普適性的標準。
4.1 定量方法的選擇
本研究的目的在于測定辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯中各脂肪酸甲酯的相對百分含量，進而反映幾種脂肪酸的占比，揭示產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)與組成，無須確定樣品中各脂肪酸甲酯的準確濃度，因而選擇使用面積歸一化法定量，但由于未進行線性與準確度的考察，還需對面積歸一化法定量的準確性和合理性進行進一步驗證。
4.2 局限性
由于辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯的生產(chǎn)廠商數(shù)量有限，故而本文僅收集了一家公司的三批樣品進行分析測定。依據(jù)測定結(jié)果，主成分辛酸甲酯和癸酸甲酯的含量較高，分別在50%以上與40%左右，明顯高于雜質(zhì)己酸甲酯、月桂酸甲酯及肉蔻酸甲酯，因而可以此來快速鑒別產(chǎn)品真?zhèn)?。此方法檢測了三種飽和酸甲酯雜質(zhì)的含量，但樣品中可能還存在其他影響產(chǎn)品質(zhì)量的不飽和酸雜質(zhì)無法通過此方法進行鑒別和測定。此外，由于僅收集了一家生產(chǎn)廠家的樣品，樣品量較少，有關(guān)辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯的脂肪酸組成限度要求如何制定有待進一步研究。
4.3 展望
脂肪酸組成是關(guān)系到油脂型輔料有效性與安全性的關(guān)鍵質(zhì)量指標之一[8]。保證主要脂肪酸組分的含量，盡量降低其他雜質(zhì)脂肪酸的百分含量，才能夠保障輔料的質(zhì)量。但現(xiàn)階段國內(nèi)關(guān)于油脂型輔料的標準還存在一定缺陷，特別是缺乏脂肪酸組成的檢測方法，對于油脂型輔料的質(zhì)量監(jiān)管存在障礙，因此需盡快研究與完善。本研究建立的氣相色譜方法，可同時測定辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯中己酸甲酯、辛酸甲酯、癸酸甲酯、月桂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯五種脂肪酸組成的含量，該方法專屬性、重復(fù)性良好，對于揭示它的結(jié)構(gòu)與組成，控制其質(zhì)量具有重要意義，為建立其與類似油脂性輔料的質(zhì)量標準、保證其有效性和安全性提供了科學(xué)依據(jù)。
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來源：中國藥品標準
