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嘉峪檢測網 2021-08-13 20:58
前 言
遺傳毒性試驗評估什么？
遺傳毒性試驗是采用哺乳動物或非哺乳動物細胞、細菌、酵母菌、真菌或整體動物測定試驗樣品是否會引起基因突變，染色體結構畸變以及其他DNA或基因變化的試驗。
遺傳毒性試驗主要用于檢測兩類主要的遺傳損傷，一類是基因突變（點突變）；另一類是染色體損傷評價，例如染色體結構畸變，染色體缺失和插入，染色體數目畸變。經過驗證，體外哺乳動物染色體畸變試驗和體外小鼠淋巴瘤TK試驗得到一致的結果，但這兩項試驗結果一致認為有遺傳毒性的化合物在細菌回復突變試驗中卻產生陰性的結果。該項試驗結果表明，單一的試驗無法檢測出所有相關遺傳物質，因此通常進行一組體外試驗。標準的遺傳毒性試驗組合中，體外哺乳動物染色體畸變試驗和體外小鼠淋巴瘤TK試驗中任何一個與細菌回復突變試驗組合，當前監管機構都認為是可以接受的。
哪些醫療器械需要進行遺傳毒性評價？
體外遺傳毒性試驗常用的為細菌回復突變試驗，體外哺乳動物染色體畸變試驗和體外小鼠淋巴瘤細胞TK試驗。接下來將一一介紹。
染色體畸變試驗簡介
試驗目的和原理
通過檢測受試物是否誘發體外培養的哺乳類細胞染色體畸變，評價受試物致突變的可能性。在加入和不加入代謝活化系統的條件下，使培養的哺乳類細胞暴露于受試物中。用中期分裂阻斷劑（如秋水仙素）處理，使細胞停止在中期分裂相，隨后收獲細胞、制片、染色、分析染色體的畸變。
染色體畸變試驗測試方法
預實驗
對懷疑有細胞毒性反應的試驗樣品應進行預實驗。宜在有或無代謝活化的情況下，使用相對群體倍增數（RPD）或者相對細胞增長數（RICC）來評估樣品的細胞毒性，以保證有足夠數目的細胞處于有絲分裂狀態。
當試驗樣品具有細胞毒性時，應以試驗樣品或浸提原液作為最高濃度組進行稀釋，即實驗用最高濃度與陰性對照相比RPD或RICC達到（55±5）%的濃度。測試一般選用3個測試濃度。
正試驗
試驗分為短期處理組（有和無代謝活化系統）和長期處理組（無代謝活化系統）。短期處理組是使用處于對數生長狀態的細胞與試驗樣品、對照樣品分別在有代謝活化系統和無代謝活化系統的情況下接觸處理3-6小時，接觸后使用PBS清洗細胞3次，加入新鮮培養基繼續培養，并在接觸開始后約1.5倍細胞正常周期時收獲細胞。長期處理組是使用處于對數生長狀態的細胞與試驗樣品、對照樣品在無代謝活化系統的情況下接觸處理約1.5倍細胞正常周期，然后收獲細胞。收獲細胞前1-3小時加入細胞分裂中期阻斷劑秋水仙素，使其終濃度在0.1µg/ml~1µg/ml。收獲細胞時，先使用胰蛋白酶消化細胞，然后將細胞放在氯化鉀溶液中進行低滲，低滲的目的是使細胞充分膨脹，易于在滴片的時候破裂。低滲后的細胞使用固定液進行反復固定，然后滴片、染色并觀察。一般每組至少評估300個處于中期分裂的細胞，記錄染色體畸變的細胞數，計算染色體畸變率。
染色體畸變試驗接受標準
質控接受標準：
a）陰性對照應在歷史陰性對照數據庫95%的控制限值范圍內；
b）陽性對照應在歷史陽性對照數據庫95%的控制限制范圍內，陽性對照與陰性對照相比應具有統計學顯著性增加。
陽性結果：
滿足質控標準下，試驗成立，若出現下列情況可判定試驗樣品呈陽性：
a）與陰性對照相比，染色體結構畸變率在統計上顯著地增加；
b）如存在多劑量組試驗時，當用適當的濃度梯度測試進行評估時存在與劑量相關的增加；
c）任一組結果超出了歷史的陰性對照數據的分布范圍（例如，95%的控制限值）。
當滿足上述所有這些標準時，認為試驗樣品在本試驗系統下具有致哺乳動物細胞染色體畸變性。
體外小鼠淋巴瘤TK試驗簡介
什么是體外小鼠淋巴瘤TK試驗
體外小鼠淋巴瘤TK試驗是一種哺乳動物體細胞基因正向突變實驗，近年來其應用價值有明顯的提高。TK基因突變的檢測終點是胸苷激酶（TK）基因的突變。人類TK基因定位于17號染色體長臂遠端；小鼠定位于11號染色體。TK基因突變屬于常染色體基因突變。
體外小鼠淋巴瘤TK試驗的目的及原理
TK基因突變的產物胸苷激酶在體內催化從脫氧胸苷（TdR）生成胸苷酸(TMP)的反應。在正常情況下，此反應并非生命所必須，原因是體內TMP主要來自于脫氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反應生成TMP。但如果在細胞培養物中加入胸苷類似物（如三氟胸苷，即trifluorothymidine，TFT）,則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，進而摻入DNA,造成致死性突變，故細胞不能存活。若TK基因發生突變，導致胸苷激酶缺陷，則TFT不能磷酸化，亦不能摻入DNA，故細胞在含有TFT的培養基中能夠生長，即表現出對TFT的抗性。根據突變集落形成數，可計算突變頻率，從而推斷受試物的致突變性。
細胞系的選擇
標準推薦選用L5178Y TK+/--3.7.2C細胞系。當試驗細胞系平均自發突變頻率超出50×10-6~170×10-6范圍時，需要對自發突變細胞進行清除。使用THMG培養基培養24h，200g離心5min，再用THG培養2天。
體外小鼠淋巴瘤TK試驗的檢測方法
預實驗：
當懷疑試驗樣品具有細胞毒性時，以試驗樣品或浸提原液作為最高濃度組進行梯度稀釋，最高的試驗濃度應為相對存活率在10%~20%的濃度，梯度稀釋宜包括從中到小或無細胞毒性的濃度范圍。
主試驗：
與染色體畸變試驗相同，同樣分為短期處理組（有和無代謝活化系統）和長期處理組（無代謝活化系統）。有活化系統與細胞懸液和試驗樣品（浸提液）及S9混合液組成，無代謝活化系統由細胞懸液和試驗樣品（浸提液）及PBS組成。然后將混合液置于37℃振蕩培養4h，后用無血清培養基洗滌細胞兩次，然后用培養基重懸。部分用于接種平板，每種劑量兩塊平板，置于37℃培養10d~12d。部分繼續進行表達，表達2天，然后接種平板，分為PE2平板接種與TFT平板接種，每種劑量同樣接種兩塊平板，置于37℃培養10d~12d。
體外小鼠淋巴瘤TK試驗的質控標準
陰性對照組：平板效率為65%~120%，突變頻率MF應為50×10-6~170×10-6；
陽性對照組：至少滿足以下兩個標準中的一個標準則試驗有效，否則應重新試驗：
1）陽性對照MF與陰性對照有顯著性差異，比陰性對照高300×10-6以上，其中陽性對照的小集落突變頻率應占40%以上。
2）陽性對照的小集落突變頻率比陰性對照高150×10-6以上。
體外小鼠淋巴瘤TK試驗的結果判定
試驗組MF與陰性對照組有顯著性差異，且超過GEF(126×10-6)以上并具有重現性，則可判定檢測結果陽性。
試驗組MF與陰性對照組沒有顯著性增長，或有增加但小于GEF(126×10-6)，則可判定檢測結果陰性。
細菌回復突變試驗簡介
試驗目的和原理
細菌回復突變試驗是檢測受試物對于微生物（細菌）的基因突變作用，預測其潛在的遺傳毒性。
細菌回復突變試驗利用鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養缺陷型菌株來檢測點突變。這類菌株本身不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養基上，僅有少數自發回復突變的細菌生長。假如有致突變物存在，則營養缺陷型菌株會回復突變成野生型，故在缺乏組氨酸的培養基上能生長形成菌落。故可以根據菌落形成的數量判斷受試樣品中是否存在致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復突變，故需要同時在存在和沒有代謝活化協同的條件下進行試驗。
試驗菌株
至少應使用五種菌株。推薦使用以下菌種組合：
1) 鼠傷寒沙門氏菌TA1535；
2) 鼠傷寒沙門氏菌TA97a或TA97或TA1537；
3) 鼠傷寒沙門氏菌TA98；
4) 鼠傷寒沙門氏菌TA100；
5) 鼠傷寒沙門氏菌TA102或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA(PKM101)。
測試方法
預實驗：
對未知或懷疑對試驗菌株有抑制作用的試驗樣品，應進行預實驗。在有或無代謝活化的情況下，用回復突變的菌落數來評估樣品是否有細胞毒性，如有抑制作用，則需對試驗樣品浸提液進行梯度稀釋，所選的劑量范圍應包括細胞毒性從最大到小或無細胞毒性，一般至少包括5個試驗濃度梯度，并以最小或者無細胞毒性的濃度按照平板滲入法進行主試驗。
主試驗（平板滲入法）：
使用移液器將冷凍保存的菌株培養物接種于5mL營養肉湯培養基無菌試管內，在37℃恒溫培養箱中培養10-12h至對數增長期，其濃度不少于1×109CFU/ml，培養瓶可用黑紙包裹，以防光線照射細菌。
融化頂層培養基，將融化好的頂層培養基分裝于無菌小試管，每管2mL，將試管放入45℃恒溫水浴鍋中保溫。在保溫的頂層培養基中依次加入每種菌株的新鮮菌液0.1mL混勻，試驗樣品組加入浸提液0.1mL，陰性對照組加入0.1mL浸提介質，陽性對照組加入0.1mL誘變劑，活化組加入0.5mL10%S9混合液，未活化組加入0.5mL 0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液，每個組做3個平行，輕輕混勻后迅速將此混合物倒入已經固化的底層培養基平皿中，轉動平皿，使頂層培養基均勻分布，平放固化。全部平皿倒置于37℃培養箱培養48~72h。培養結束后計數并記錄每個平皿的菌落數，并計算3個平皿的平均數和標準差。
接受標準
質控接受標準：
陰性對照組細菌回復突變數應在自發回復突變菌落數范圍內；
陽性對照組的菌落數應與陰性對照組菌落數存在顯著性增加；否則對不在范圍內的菌株應重新進行試驗。
結果判定：
至少有一個試驗菌株，無論在+S9或-S9條件下，試驗樣品組的細菌回復突變菌落數在一個或多個濃度條件下呈現可重復性的增長，并具有統計學意義的為陽性結果。
結果符合上述標準的試驗物質被認為有致突變性。
來源：海河生物
