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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2022-05-25 21:28
摘要：肺炎球菌多糖疫苗或多糖蛋白結(jié)合疫苗在預(yù)防肺炎球菌性疾病中發(fā)揮著重要的作用。肺炎鏈球菌是肺炎球菌疫苗研制、生產(chǎn)的重要原材料，也是國(guó)家重要的戰(zhàn)略儲(chǔ)備資源，其質(zhì)量直接或間接影響終產(chǎn)品肺炎球菌疫苗的質(zhì)量、安全和效力。因此，嚴(yán)格控制肺炎球菌疫苗生產(chǎn)用肺炎鏈球菌的質(zhì)量至關(guān)重要。本文對(duì)肺炎球菌疫苗生產(chǎn)用肺炎鏈球菌種子批的傳統(tǒng)檢定方法和分子生物學(xué)檢定方法(16S rRNA序列測(cè)定、基于PCR的血清分型、多位點(diǎn)序列分型、脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型和全基因組序列測(cè)序)進(jìn)行概述，并對(duì)這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行討論，以期為完善生產(chǎn)用肺炎鏈球菌種的質(zhì)控方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供幫助。
關(guān)鍵詞：肺炎球菌疫苗；肺炎鏈球菌；傳統(tǒng)檢定方法；分子生物學(xué)檢定方法
Abstract: Pneumococcal polysaccharide vaccine or polysaccharide conjugate vaccine plays an important role in preventing pneumococcal diseases. Streptococcus pneumoniae is an important raw material for the development and production of pneumococcal vaccine, as well as an important national strategic reserve resource. Its quality directly or indirectly affects the quality, safety and efficacy of the final product pneumococcal vaccine. Therefore, it is very important to strictly control the quality of Streptococcus pneumoniae used for the production of pneumococcal vaccine. In this paper, the traditional quality control method and molecular biological method (16S rRNA gene sequencing, PCRbased serotyping, multilocus sequence typing, pulsed field gel electrophoresis and whole genome sequencing) used for the quality control of the seed batch of Streptococcus pneumoniae for pneumococcal vaccine production are summarized, and the advantages and disadvantages of these methods are discussed, in order to provide supports for the improvement of quality control methods and quality standards of Streptococcus pneumoniae for pneumococcal vaccine production.
Key words：pneumococcal vaccine; Streptococcus pneumoniae; traditional quality control method; molecular biological methods
1 引言
肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是引起兒童和老年人肺炎球菌性疾病的主要病原菌，其感染可引起急性中耳炎、鼻竇炎、肺炎、腦膜炎、菌血癥等[1]。WHO已將肺炎球菌性疾病列為需“極高度優(yōu)先”使用疫苗預(yù)防的疾病。肺炎球菌多糖疫苗或多糖蛋白結(jié)合疫苗在預(yù)防肺炎球菌性疾病中發(fā)揮著重要的作用。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站查詢顯示，我國(guó)有5款23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗(PPSV23)和3款13價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗(PCV13)上市銷(xiāo)售。根據(jù)肺炎鏈球菌主要毒力因子莢膜多糖抗原的不同，肺炎鏈球菌可以分為90多個(gè)血清型[2]。其中，最流行的血清型是19F、19A、23F、14、6A和6B型[3]。目前肺炎球菌疫苗生產(chǎn)用菌種包括24個(gè)型別，分別是1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型。肺炎鏈球菌是肺炎球菌疫苗研制、生產(chǎn)的重要原材料，也是國(guó)家重要的戰(zhàn)略儲(chǔ)備資源，其質(zhì)量直接或間接影響肺炎球菌疫苗的質(zhì)量、安全和效力[4]。因此，嚴(yán)格控制肺炎鏈球菌生產(chǎn)菌種的質(zhì)量至關(guān)重要。
肺炎鏈球菌生產(chǎn)菌種質(zhì)量控制應(yīng)符合《中華人民共和國(guó)藥典》(簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》)2020年版三部“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制”的有關(guān)規(guī)定。生產(chǎn)菌種應(yīng)建立原始種子批、主種子批和工作種子批三級(jí)種子批系統(tǒng)。原始種子應(yīng)驗(yàn)明其歷史、來(lái)源和生物學(xué)特性。工作種子批的生物學(xué)特性應(yīng)與原始種子一致。每批主種子批和工作種子批均應(yīng)按照國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門(mén)批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)和生產(chǎn)規(guī)程的要求保管、檢定和使用。生產(chǎn)用菌種主種子批檢定一般應(yīng)包括培養(yǎng)特性、革蘭氏等染色方法鏡檢、生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗(yàn)、毒力試驗(yàn)、免疫效價(jià)測(cè)定、培養(yǎng)物純度、活菌數(shù)測(cè)定、16S rRNA 序列測(cè)定、全基因序列測(cè)定等項(xiàng)目[5]。
培養(yǎng)特性、染色鏡檢、生化反應(yīng)、膽汁溶菌試驗(yàn)、奧普托欣試驗(yàn)和莢膜腫脹試驗(yàn)等傳統(tǒng)的經(jīng)典肺炎鏈球菌質(zhì)量控制方法在菌株的分離、鑒定和質(zhì)量控制中發(fā)揮了重要的作用[6]，但傳統(tǒng)方法需要活菌操作，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別有較高要求，且存在無(wú)法準(zhǔn)確分辨菌株之間的差異的局限。近年來(lái)，以16S rRNA序列測(cè)定、基于PCR的血清分型(PCRbased serotyping)、多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分型和全基因組序列測(cè)序(whole genome sequencing)為代表的分子生物學(xué)方法，以其快速、敏感性高、特異性強(qiáng)以及分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，且能夠識(shí)別株水平的菌種差異，在細(xì)菌鑒定、流行病學(xué)調(diào)查、系統(tǒng)進(jìn)化研究等方面發(fā)揮了重要的作用，也逐漸應(yīng)用于肺炎鏈球菌的分子鑒定中[7，8]。
本文對(duì)肺炎球菌疫苗生產(chǎn)用肺炎鏈球菌種子批的傳統(tǒng)檢定方法和分子生物學(xué)檢定方法進(jìn)行概述，并對(duì)這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行討論，以期為完善生產(chǎn)用肺炎鏈球菌種的質(zhì)控方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供幫助。
2 肺炎鏈球菌種子批的傳統(tǒng)檢定方法
《中國(guó)藥典》2020年版三部通則中對(duì)生物制品生產(chǎn)用菌種的原始種子批、主種子批和工作種子批均有相應(yīng)的檢定要求[5]。表1列出了《中國(guó)藥典》收錄的23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗種子批的檢定項(xiàng)目和相應(yīng)的檢定標(biāo)準(zhǔn)，這些規(guī)定對(duì)統(tǒng)一和規(guī)范疫苗生產(chǎn)企業(yè)對(duì)肺炎疫苗生產(chǎn)菌種的質(zhì)量控制，從源頭上把控肺炎疫苗的質(zhì)量起到關(guān)鍵作用。
在實(shí)際檢驗(yàn)過(guò)程中，肺炎鏈球菌種子批的培養(yǎng)特性、染色鏡檢、生化反應(yīng)、膽汁溶菌試驗(yàn)、奧普托欣試驗(yàn)和莢膜腫脹試驗(yàn)，很少出現(xiàn)問(wèn)題，但這些試驗(yàn)主要依靠檢測(cè)人員的直接觀察，主觀性強(qiáng)，對(duì)檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)要求較高。采用糖發(fā)酵方法的生化反應(yīng)鑒定時(shí)間持續(xù)3～5d。針對(duì)生化反應(yīng)情況，采用梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定試驗(yàn)系統(tǒng)(vitek2)或BIOLOG高通量微生物表型及鑒定分析系統(tǒng)進(jìn)行生化反應(yīng)檢定，鑒定工作一般可以縮短在24 h內(nèi)完成。
近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道鑒定出對(duì)奧普托欣(Optochin)耐藥的肺炎鏈球菌[9-12]。Burton等[13]直接使用具有Optochin抗性的肺炎鏈球菌作為肺炎球菌抗體多重調(diào)理吞噬試驗(yàn)(multiplexed opsonization assay, MOPA)的靶菌，用于評(píng)價(jià)肺炎球菌疫苗的效力。在肺炎鏈球菌種子批檢定中，發(fā)現(xiàn)個(gè)別企業(yè)的某些型別的肺炎鏈球菌奧普托欣試驗(yàn)抑菌圈直徑小于14 mm或者處于臨界狀態(tài)，但膽汁溶菌試驗(yàn)為陽(yáng)性，表明采用的生產(chǎn)菌種為耐奧普托欣肺炎鏈球菌。目前，Optochin試驗(yàn)僅作為一種肺炎鏈球菌鑒定的手段，抑菌圈直徑小于14 mm或者處于臨界狀態(tài)，也可能是肺炎鏈球菌，需要輔助以膽汁溶菌試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。肺炎球菌疫苗多為組分疫苗，奧普托欣抗性肺炎鏈球菌對(duì)肺炎鏈球菌莢膜多糖生產(chǎn)是否具有影響，可否用于肺炎球菌疫苗的生產(chǎn)，還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，需要后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證。
3 肺炎鏈球菌種子批的分子生物學(xué)檢定方法
3.1 16S rRNA序列測(cè)定
16S rRNA序列測(cè)定是通過(guò)對(duì)細(xì)菌16S核糖體RNA(16S ribosomal RNA gene, 16S rRNA )基因特征序列的測(cè)定，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的生物學(xué)鑒定。細(xì)菌16S rRNA基因全長(zhǎng)約1 500 bp，包含9個(gè)可變區(qū)(variable region，V區(qū))和10個(gè)恒定區(qū)(Constant region，C區(qū))，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度保守性，是細(xì)菌分類(lèi)和鑒定中得到廣泛應(yīng)用的DNA特征序列之一。細(xì)菌性疫苗生產(chǎn)用菌種16S rRNA序列測(cè)定可參照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則“1021 細(xì)菌DNA特征序列鑒定法”進(jìn)行[14，15]。
《中國(guó)藥典》方法擴(kuò)增的是16S rRNA基因V1～V3可變區(qū)核酸序列，采用的擴(kuò)增引物是16SV1F和16SV3R，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為500 bp。以擴(kuò)增引物作為測(cè)序引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，從而獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸序列，核酸序列需去除引物序列，序列方向應(yīng)與16SV1F引物方向一致。有一些細(xì)菌可能在V1～V3可變區(qū)外出現(xiàn)基因多態(tài)性，對(duì)于特定菌種建議使用16S rRNA基因全長(zhǎng)引物27F和1492R進(jìn)行擴(kuò)增分析[14，16]。16S rRNA序列測(cè)定結(jié)果判定是“將獲得的細(xì)菌DNA特征序列與經(jīng)驗(yàn)證過(guò)的專(zhuān)用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。”，但未對(duì)比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)做出具體規(guī)定。目前普遍使用的比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)有美國(guó)的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)和韓國(guó)的EzBioCloud 16S數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ezbiocloud.net/)。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的16S rRNA基因數(shù)據(jù)量大，但缺乏有效的驗(yàn)證和篩選。EzBioCloud 16S數(shù)據(jù)庫(kù)是經(jīng)過(guò)有效驗(yàn)證和質(zhì)量篩選的、以收錄模式菌株數(shù)據(jù)為主的數(shù)據(jù)庫(kù)。雖然兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的結(jié)果大多數(shù)情況下是一致的，但EzBioCloud 16S數(shù)據(jù)庫(kù)可信度更高[17]。
16S rRNA序列測(cè)定可以準(zhǔn)確鑒定絕大多數(shù)菌種的種屬，但對(duì)同一種屬內(nèi)親緣關(guān)系很近的種分辨率不夠。多價(jià)肺炎球菌疫苗生產(chǎn)菌種涉及20多個(gè)不同血清型別，16S rRNA序列測(cè)定可以將生產(chǎn)菌種鑒定到肺炎鏈球菌，但無(wú)法區(qū)分各個(gè)不同血清型別的疫苗生產(chǎn)菌種[16]，如需進(jìn)一步區(qū)分可以進(jìn)行基于PCR的血清分型。
3.2 基于PCR的血清分型(PCRbased serotyping)
除3型和37型采用合成酶途徑(synthase)外，其它所有型別的肺炎鏈球菌莢膜多糖(capsular polysaccharide, CPS)均是由依賴多糖重復(fù)單位聚合酶(Wzy)的途徑合成，由位于染色體上的莢膜多糖合成基因簇(cps loci)控制，cps基因簇介于dexB和aliA基因之間[18]。目前已完成90個(gè)血清型的cps基因序列測(cè)定[19]。cps基因簇的前四個(gè)基因(cpsA、cpsB、cpsC和cpsD)在幾乎所有血清型中都是保守的，而位點(diǎn)的中心部分包含血清型特異性基因，這些基因是通過(guò)基于PCR的方法區(qū)分肺炎鏈球菌的基礎(chǔ)。研究人員以cps基因簇為靶基因，設(shè)計(jì)了一系列引物，建立了基于PCR的檢測(cè)分析肺炎鏈球菌血清型的方法。美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心(CDC)官網(wǎng)公布了鑒定41種肺炎鏈球菌莢膜血清型的引物序列(https：//www.cdc.gov/streplab/pneumococcus/resources.html#deductionconventional)。表2列出了24種肺炎球菌疫苗血清型特異性基因及PCR產(chǎn)物理論片段的大小。目前，已經(jīng)有文獻(xiàn)發(fā)表基于PCR的血清分型方法適用于肺炎鏈球菌國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌株的鑒定和質(zhì)量控制[16]。
與傳統(tǒng)的血清凝集血清型分析方法比較，基于PCR的血清型分型方法具有不要求活菌培養(yǎng)、快速、靈敏的特點(diǎn)，但仍存在一些血清型不能精確分型問(wèn)題，如6A和6B型，20A和20B。由于6A和6B的型特異性基因wci P的大小相同，且6A與6B之間僅是一個(gè)單堿基的差別(G584A)，PCR血清分型不能準(zhǔn)確區(qū)分，需要通過(guò)wci P基因序列測(cè)定進(jìn)一步區(qū)分6A和6B血清型[20-22]。20型肺炎鏈球菌是肺炎球菌疫苗包含的重要血清型別。研究結(jié)果表明，20型肺炎鏈球菌的莢膜多糖具有六糖重復(fù)單位和七糖重復(fù)單位2種結(jié)構(gòu)。具有六糖重復(fù)單位的20型被命名為20A亞型，七糖重復(fù)單位的20型被命名為20B亞型，基于wci L的PCR血清分型雖然能夠?qū)?0型肺炎鏈球菌與其他型別分開(kāi)，但無(wú)法區(qū)分20A和20B，還需要進(jìn)行wha F基因測(cè)序，對(duì)20 型肺炎鏈球菌進(jìn)行進(jìn)一步區(qū)分[23]。
此外，由于有些型別的肺炎鏈球菌血清型特異性基因PCR產(chǎn)物的大小相近，凝膠電泳區(qū)分度有限，如果結(jié)合分辨率更高毛細(xì)管電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物的分析，能夠更加精確的進(jìn)行血清型的鑒定[24]。
3.3 多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)
肺炎鏈球菌MLST分型，即PCR擴(kuò)增肺炎鏈球菌7種看家基因(aroE、gdh、gki、recP、spi、xpt和ddl)，并將測(cè)序得到的7個(gè)看家基因序列與肺炎鏈球菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//pubmlst.org/organisms/streptococcuspneumoniae/)進(jìn)行比對(duì)，獲得相應(yīng)的等位基因編號(hào)(或者申請(qǐng)新的編號(hào))，所有等位基因的編號(hào)(aroEgdhgkirecPspixptddl)組成菌株最終的基因序列型(sequence type，ST)。截止到2022年2月2日，MLST數(shù)據(jù)庫(kù)已收集了全世界不同國(guó)家和地區(qū)、不同來(lái)源的73 777株肺炎鏈球菌的MLST信息，共發(fā)現(xiàn)283 046種序列型[25]。Zhou M等[26]研究了中國(guó)300株侵襲性肺炎鏈球菌的MLST分布，發(fā)現(xiàn)最常見(jiàn)的 ST型是分別是ST320、ST81、ST271、ST876和ST3173。Shi W等[27]從兒童中分離的15群肺炎鏈球菌中最常見(jiàn)的克隆群(clonal complex)是CC3397、CC6011、CC10088、CC9785和ST8589。Peng S等[28]用MLST方法研究83株肺炎鏈球菌，發(fā)現(xiàn)最常見(jiàn)的ST型是ST271、ST320和ST3397。陳瓊等[29-30]通過(guò)MLST獲得了6群和11群肺炎鏈球菌疫苗生產(chǎn)用菌種不同的ST型。
MLST分型方法具有準(zhǔn)確、快速、易于標(biāo)準(zhǔn)化、便于在不同實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行比較分析的特點(diǎn)，可以檢測(cè)到菌株特征性的ST，并可反映菌株之間的分子進(jìn)化關(guān)系[31]。不同血清型的肺炎鏈球菌通常具有不同的ST型，同一血清型內(nèi)的不同菌株可能具有相同的ST型，所以，當(dāng)同一血清型的不同生產(chǎn)用菌株具有相同的ST型時(shí)，需要采用分辨率更高的方法進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，如脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分型或全基因組測(cè)序的方法。
3.4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分型
肺炎鏈球菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳是先將肺炎鏈球菌包埋于瓊脂塊中，原位裂解膠塊中的菌體，再利用限制性核酸內(nèi)切酶(通常為 Sma I)對(duì)菌體全基因組DNA進(jìn)行酶切，酶切片段進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳后，通過(guò)專(zhuān)業(yè)的聚類(lèi)分析軟件進(jìn)行電泳圖譜和親緣關(guān)系分析的一種分型方法[32-33]。PFGE分型方法因其高分別率，被認(rèn)為是研究近緣菌株間差異和進(jìn)化的金標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果表明相同的血清型或ST型菌株可能具有不同的PFGE圖譜[16]。黃洋等[34]用PFGE分型方法獲得了24株檢測(cè)肺炎球菌疫苗功能性抗體的標(biāo)準(zhǔn)株的PFGE圖譜，發(fā)現(xiàn)各血清群/型的菌株P(guān)FGE圖譜具有12～15個(gè)特征性的條帶。PFGE方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好以及分辨率高，非常適合于菌株的流行病學(xué)溯源分析，在肺炎鏈球菌相同血清型和ST型菌株的鑒定上很有優(yōu)勢(shì)，其主要不足是操作步驟相對(duì)繁瑣、實(shí)驗(yàn)影響因素多、實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，不易標(biāo)準(zhǔn)化。
3.5 全基因組序列測(cè)序(whole genome sequencing)
近年來(lái)，基因組測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，測(cè)序成本逐漸下降，測(cè)序周期縮短、測(cè)序精度不斷提高，二代、三代基因組測(cè)序技術(shù)逐漸在病原體監(jiān)測(cè)、疫苗等生物制品研發(fā)及生產(chǎn)用菌毒種質(zhì)量控制中得到應(yīng)用[35-38]。截止2022年2月，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的已完成全基因組測(cè)序的肺炎鏈球菌菌株有9 029株。基因組大小約為2.085 98 Mb，平均GC含量約為39.6%，約編碼1951個(gè)基因。測(cè)序使用的主要方法包括Illumina平臺(tái)、PacBio平臺(tái)及最新的單分子Nanopore測(cè)序平臺(tái)[39-41]。采用基因組測(cè)序的手段不但可以解析肺炎鏈球菌本身蘊(yùn)含的全部遺傳信息，還能夠全面的了解疫苗應(yīng)用后肺炎鏈球菌菌群發(fā)生的適應(yīng)性變化，從而為新型疫苗的研發(fā)提供指導(dǎo)。Croucher NJ等[42]利用Illumina HiSeq平臺(tái)對(duì)收集的616株兒童攜帶的肺炎鏈球菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)疫苗免疫接種后，疫苗血清型引起的肺炎球菌疾病的發(fā)病率下降，而非疫苗血清引起的疾病增加，出現(xiàn)血清型替換現(xiàn)象。Li L等[43]采用三代Pacific Biosciences 和 Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)19A型肺炎鏈球菌基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析。Nakano S等[44]對(duì)19A型ST320菌株進(jìn)行了基于基因組數(shù)據(jù)的系統(tǒng)區(qū)域分布研究。Rockett RJ等[45]對(duì)采用基因組測(cè)序的方法對(duì)PCV疫苗應(yīng)用后19群肺炎鏈球菌基因組維度的差異進(jìn)行了分析。Yan Z等[46]用基因組測(cè)序的方式對(duì)肺炎鏈球菌血清型和ST型等進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)最常見(jiàn)的血清型是19F、19A、6B、6A和14，主要的ST型為ST271、ST320和ST90。Gagetti P等[47]采用全基因測(cè)序方法研究肺炎鏈球菌群體結(jié)構(gòu)、ST分型和克隆群(clonal complexes，CCs)。Cuppone AM等[48]使用Nanopore 和Illumina相結(jié)合的測(cè)序技術(shù)測(cè)定了肺炎鏈球菌Rx1的全基因組序列，基因組全長(zhǎng)2.03 Mb，有2 054個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF), GC含量39.72%。
《中國(guó)藥典》2020年版三部通則《生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制》中要求建立生產(chǎn)用菌種種子批全基因序列的背景資料，生產(chǎn)用菌種主種子批應(yīng)進(jìn)行全基因序列測(cè)定。目前，可以利用不同的測(cè)序平臺(tái)在短時(shí)間內(nèi)獲得生產(chǎn)用菌毒種全基因組序列結(jié)果，但由于測(cè)序樣本制備的完整性不佳或不同的測(cè)序技術(shù)所用的基因組拼接算法的不同，可能會(huì)導(dǎo)致采用不同測(cè)序技術(shù)得到基因組序列存在差異，對(duì)基因組測(cè)序結(jié)果的解析造成困難。與病毒相比，建立基于細(xì)菌全基因組序列的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較困難，建議在進(jìn)行不同批次的菌種全基因組比較時(shí)，采用同一種測(cè)序技術(shù)平臺(tái)，重點(diǎn)對(duì)影響菌種質(zhì)量或產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵區(qū)域，如莢膜多糖合成位點(diǎn)(cps loci)進(jìn)行比對(duì)分析，針對(duì)不同的區(qū)域制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
根據(jù)各分子生物檢測(cè)方法的特點(diǎn)，表3列出了肺炎鏈球菌生產(chǎn)菌種種子批分子生物學(xué)檢定項(xiàng)目及暫行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，希望可以作為肺炎鏈球菌經(jīng)典的檢定方法有力補(bǔ)充，進(jìn)一步完善肺炎鏈球菌生產(chǎn)菌種的信息。
4 總結(jié)與展望
肺炎球菌多糖疫苗或多糖蛋白結(jié)合疫苗在預(yù)防肺炎球菌性疾病中發(fā)揮著重要的作用。肺炎鏈球菌是肺炎球菌疫苗研制、生產(chǎn)的重要原材料，也是國(guó)家重要的戰(zhàn)略儲(chǔ)備資源，其質(zhì)量直接或間接影響終產(chǎn)品肺炎球菌疫苗的質(zhì)量、安全和效力。因此，嚴(yán)格控制肺炎球菌疫苗生產(chǎn)用肺炎鏈球菌質(zhì)量至關(guān)重要，應(yīng)該從菌種的來(lái)源、種子批系統(tǒng)的建立及檢定、傳代次數(shù)、生物安全等方面重點(diǎn)關(guān)注和全面嚴(yán)格要求。其中，種子批系統(tǒng)的建立及檢定又是重中之重。
肺炎鏈球菌傳統(tǒng)的經(jīng)典的檢定方法在各級(jí)種子批的檢定過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，對(duì)肺炎疫苗的質(zhì)量起到基礎(chǔ)的保障作用[6]，但經(jīng)典的檢定方法主要以區(qū)分菌株的表型差異為主，需要活菌操作，主觀性強(qiáng)，對(duì)操作人員的經(jīng)驗(yàn)有較高要求，不能很好地區(qū)分相同表型的不同菌株之間的差別。近年來(lái)，逐漸成熟和經(jīng)過(guò)實(shí)踐驗(yàn)證的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，如16S rRNA序列測(cè)定、基于PCR的血清分型、MLST分型、PFGE分型及全基因組測(cè)序以其快速、敏感性高、特異性強(qiáng)以及分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，逐漸被應(yīng)用于肺炎鏈球菌的鑒定和溯源分析中。然而，由于不同分子分型方法的基本原理不同，再加肺炎鏈球菌的型別眾多，可能會(huì)導(dǎo)致不同方法對(duì)同一菌株的分型結(jié)果并不完全一致，且各種方法均存在自身的缺點(diǎn)，例如，16S rRNA序列測(cè)定無(wú)法區(qū)分不同型別的肺炎鏈球菌；基于PCR的血清型分型方法存在一些血清型不能精確分型問(wèn)題，如6A和6B型，20A和20B；MLST分型無(wú)法區(qū)分具有相同ST型的同一血清型的不同菌株；PFGE分型操作步驟相對(duì)繁瑣、實(shí)驗(yàn)影響因素多、實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，不易標(biāo)準(zhǔn)化；建立基于細(xì)菌全基因組序列的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較困難。因此，在肺炎鏈球菌生產(chǎn)菌種檢定中在傳統(tǒng)經(jīng)典檢定方法的基礎(chǔ)上，應(yīng)選用一種或幾種分子生物學(xué)方法作為生產(chǎn)菌種的補(bǔ)充檢定方法，并推進(jìn)分子生物學(xué)方法的標(biāo)準(zhǔn)化，最終形成一套操作簡(jiǎn)便、分辨力強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的生產(chǎn)菌種質(zhì)量檢定方法和標(biāo)準(zhǔn)，確保生產(chǎn)用肺炎鏈球菌菌種的準(zhǔn)確無(wú)誤，從源頭上為肺炎球菌疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量保駕護(hù)航。
總之，本文對(duì)肺炎球菌疫苗生產(chǎn)用肺炎鏈球菌種子批的傳統(tǒng)檢定方法和分子生物學(xué)檢定方法進(jìn)行概述，通過(guò)對(duì)生產(chǎn)用菌種實(shí)際檢定中出現(xiàn)的相關(guān)問(wèn)題研究探討，厘清了一些質(zhì)量控制的薄弱環(huán)節(jié)，為后續(xù)進(jìn)一步根據(jù)不同檢驗(yàn)方法的特點(diǎn)制定新的適宜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供幫助。
參考文獻(xiàn)
[1] 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)， 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)疫苗與免疫分會(huì). 肺炎球菌性疾病免疫預(yù)防專(zhuān)家共識(shí)(2020版)[J]. 中華流行病學(xué)雜志， 2020, 41(12)：1945
Chinese Preventive Medical Association, Vaccine and Immunology Branch of Chinese Preventive Medical Association.Expert consensus on immunoprophylaxis of pneumococcal disease(2020 version)[J]. Chin J Epidemiol, 2020, 41(12)：1945
[2] GENO KA, GILBERT GL, SONG JY, et al. Pneumococcal capsules and their types: past, present, and future[J]. Clin Microbiol Rev, 2015, 28(3): 871
[3] WANG Q, SHI W, LI Y, et al. Serotype distribution of Streptococcus pneumoniae isolated from children hospitalized in Beijing children′s hospital (20132019)[J]. Vaccine, 2020, 38(49)：7858
[4] 王軍志.疫苗的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社， 2013：79
WANG JZ.Vaccine quality control and evaluation[M]. Beijing：People′s Medical Publishing House, 2013：79
[5] 中華人民共和國(guó)藥典2020年版.三部[S]. 2020：8
ChP 2020. Vol Ⅲ[S]. 2020：8
[6] 陳馳， 肖磊， 石繼春， 等. 277株肺炎鏈球菌生物學(xué)鑒定及血清學(xué)分型結(jié)果分析[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊， 2011, 13(10): 1774
CHEN C, XIAO L, SHI JC, et al. Identification and serotyping result analysis of 277 strains of Streptococcus pneumoniae[J].Chin J Med Guide, 2011, 13(10)：1774
[7] 楊越， 葉強(qiáng).肺炎鏈球菌分子分型方法研究進(jìn)展[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志， 2013, 33(10)：789
YANG Y, YE Q.Advances in molecular typing of Streptococcus pneumoniae[J]. Chin J Microbiol Immunol, 2013, 33(10)：789
[8] EL AILA NA, EMLER S, KAIJALAINEN T, et al. The development of a 16S rRNA gene based PCR for the identification of Streptococcus pneumoniae and comparison with four other species specific PCR assays[J]. BMC Infect Dis, 2010, 10：104
[9] SOUZA ARV, DE PINA SECM, COSTA NS, et al. Description of optochinresistant Streptococcus pneumoniae due to an uncommon mutation in the atpA gene and comparison with previously identified atpC mutants from Brazil[J]. Sci Rep,2021, 11(1)：7936
[10] 王奔， 王曉， 王旭娜， 等. 兒童痰液標(biāo)本中耐奧普托欣肺炎鏈球菌的分離及藥敏情況[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2021, 31(10)：1201
WANG B, WANG X, WANG XN, et al. Isolation and drug sensitivity of optopoxinresistant Streptococcus pneumoniae from sputum samples of children[J]. Chin J Health Lab Tec, 2021, 31(10)：1201
[11] NUNES S, SÁLEÃO R, DE LENCASTRE H. Optochin resistance among Streptococcus pneumoniae strains colonizing healthy children in Portugal[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(1)：321
[12] PIKIS A, CAMPOS JM, RODRIGUEZ WJ, et al. Optochin resistance in Streptococcus pneumoniae: mechanism,significance, and clinical implications[J]. J Infect Dis, 2001, 184(5)：582
[13] BURTON RL, NAHM MH. Development and validation of a four fold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies[J]. Clin Vaccine Immunol, 2006, 13(9): 1004
[14] ABELLANSCHNEYDER I, MATCHADO MS, REITMEIER S, et al. Primer, pipelines, parameters: issues in 16S rRNA gene sequencing [J]. mSphere, 2021, 6(1)：e0120220
[15] 中華人民共和國(guó)藥典2020年版.四部 [S]. 2020: 通則1021
ChP 2020. Vol Ⅳ[S]. 2020: General Chapters 1021
[16] 李康， 黃洋， 徐瀟， 等.19群肺炎鏈球菌國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌株分子特征分析及在菌株質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展， 2019, 47(6)：20
LI K, HUANG Y, XU X, et al. Molecular characterization of national standard strains of serogroup 19Streptococcus pneumoniae and its application in quality control[J]. Prog Microbiol Immunol, 2019, 47(6)：20
[17] YOON SH, HA SM, KWON S, et al. Introducing EzBioCloud: a taxonomically united database of 16S rRNA gene sequences and whole genome assemblies[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2017, 67(5)：1613
[18] AANENSEN DM, MAVROIDI A, BENTLEY SD, et al. Predicted functions and linkage specificities of the products of the Streptococcus pneumoniae capsular biosynthetic loci [J]. J Bacteriol, 2007, 189(21): 7856
[19] BENTLEY SD, AANENSEN DM, MAVROIDI A, et al.Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes[J]. PLoS Genet. 2006, 2(3)：e31
[20] SONG JH, BAEK JY, KO KS. Comparison of capsular genes of Streptococcus pneumoniae serotype 6A, 6B, 6C, and6D isolates[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(5)：1758
[21] 陳瓊， 李康， 梁麗， 等.應(yīng)用分子生物學(xué)方法鑒定6群肺炎鏈球菌血清型[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展， 2016, 44(4)：12
CHEN Q, LI K, LIANG L, et al. Identification of Streptococcus pneumonia serogroup 6 by molecular biological technology[J]. Prog Microbiol Immunol, 2016, 44(4)：12
[22] 陳瓊， 陳馳， 石繼春， 等.應(yīng)用PCR 技術(shù)和wciP基因測(cè)序方法鑒定6群肺炎鏈球菌血清型[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志， 2014, 34(4)：315
CHEN Q, CHEN C, SHI JC, et al. PCR analysis and wciP gene sequencing for determining the serotypes of Streptococcus pneumonia serogroup 6 strains[J].Chin J Microbiol Immunol, 2014, 34(4)：315
[23] 陳瓊， 李康， 徐瀟， 等.應(yīng)用whaF基因序列鑒定20型肺炎鏈球菌血清型[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展， 2016, 44(2)：16
CHEN Q, LI K, XU X, et al. Identification of Streptococcus pneumonia serotype 20 with whaF gene sequencing[J]. Prog Microbiol Immunol, 2016, 44(2)：16
[24] SELVA L, DEL AMO E, BROTONS P, et al.Rapid and easy identification of capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae by use of fragment analysis by automated fluorescence based capillary electrophoresis[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(11)：3451
[25] JOLLEY KA, BRAY JE, MAIDEN MCJ. Openaccess bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications[J]. Wellcome Open Res, 2018, 3：124
[26] ZHOU M, WANG Z, ZHANG L, et al.Serotype distribution, antimicrobial susceptibility, multilocus sequencing type and virulence of invasive Streptococcus pneumoniae in China: a sixyear multicenter study[J]. Front Microbiol,2021, 12：798750
[27] SHI W, DU Q, YUAN L, et al.Antibiotic resistance and molecular biological characteristics of non13valentpneumococcal conjugate vaccine serogroup 15 Streptococcus pneumoniae isolated from children in China[J]. Front Microbiol, 2021, 12：778985
[28] PENG S, REN H, DENG J, et al.Genotypic and phenotypic characteristics of Streptococcus pneumoniae from community acquired pneumonia patients and healthy asymptomatic participants in Sichuan province, China[J]. BMC Infect Dis, 2021, 21(1)：1030
[29] 陳瓊， 龍新星， 李紅， 等.6群肺炎鏈球菌莢膜多糖合成相關(guān)基因的分子生物學(xué)研究[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2017, 45(4)：8
CHEN Q, LONG XX, LI H, et al.Biomolecular analysis of capsular polysaccharide synthesis genes from Streptococcus pneumoniae serogroup 6[J]. Prog Microbiol Immunol, 2017, 45(4)：8
[30] 陳瓊， 龍新星， 李紅， 等.11群肺炎鏈球菌莢膜多糖合成相關(guān)基因的分子生物學(xué)研究[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2018, 46(5)：49
CHEN Q, LONG XX, LI H, et al.Analysis of capsular polysaccharide synthesis genes from Streptococcus pneumoniae serogroup 11[J]. Prog Microbiol Immunol, 2018, 46(5)：49
[31] 錢(qián)婧， 薛蓮， 謝貴林， 等. 171株兒童侵襲性肺炎鏈球菌血清分型和多位點(diǎn)序列分型研究[J]. 臨床兒科雜志，2012, 30(2): 187
QIAN J, XUE L, XIE GL, et al.Serotyping and multilocus sequence typing of 171 isolates from children with invasive pneumococcal diseases[J]. J Clin Pediatr, 2012, 30(2)：187
[32] MCELLISTREM MC, STOUT JE, HARRISON LH. Simplified protocol for pulsed field gel electrophoresis analysis of Streptococcus pneumoniae[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(1)：351
[33] 李馬超， 張麒， 任紅宇， 等.我國(guó)部分地區(qū)肺炎鏈球菌血清分型與脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型分析[J]. 中國(guó)疫苗和免疫，2010, 16(3)：265
LI MC, ZHANG Q, REN HY, et al.Analysis on pneumococcus isolated from part of China using serotype and pulsedfield gel electrophoresis[J]. Chin J Vacc Immun, 2010, 16(3)：265
[34] 黃洋， 徐瀟， 李康， 等.檢測(cè)肺炎球菌疫苗功能性抗體的標(biāo)準(zhǔn)株分子特征分析[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2021, 35(5)：509
HUANG Y, XU X, LI K, et al. Molecular genetic analysis of standard strains for functional antibody detection of pneumococcal polysaccharide vaccine[J]. Chin J Exp Clin Virol, 2021, 35(5)：509
[35] BENTLEY SD, LO SW. Global genomic pathogen surveillance to inform vaccine strategies: a decadelong expedition in pneumococcal genomics[J]. Genome Med, 2021, 13(1)：84
[36] ALMEIDA SCG, LO SW, HAWKINS PA, et al. Genomic surveillance of invasive Streptococcus pneumoniae isolates in the period prePCV10 and postPCV10 introduction in Brazil[J]. Microb Genom,2021, 7(10)：000635
[37] KOZÁKOVÁ J, OKONJI Z, HONSKUS M. Population analysis of Streptococcus pneumoniae serotype 19A by whole genome sequencing in the Czech Republic and in Europe after serotype 19A inclusion in pneumococcal conjugate vaccine[J]. Epidemiol Mikrobiol Imunol, 2021, 70(2)：110
[38] NAGARAJ G, GOVINDAN V, GANAIE F, et al. Streptococcus pneumoniae genomic datasets from an Indian population describing prevaccine evolutionary epidemiology using a whole genome sequencing approach[J]. Microb Genom, 2021, 7(9)：000645
[39] GOLDEN AR, ADAM HJ, BAXTER M, et al. Whole genome characterization of Streptococcus pneumoniae from respiratory and blood cultures collected from Canadian hospitals before and after PCV13 implementation in Canada: Focus on serotypes 22F and 33F from CANWARD 20072018[J]. Vaccine, 2021, 39(39)：5474
[40] SLAGER J, APRIANTO R, VEENING JW. Deep genome annotation of the opportunistic human pathogenStreptococcus pneumoniae D39[J]. Nucleic Acids Res, 2018, 46(19)：9971
[41] GARCIAGARCIA S, PEREZARGUELLO A, HENARES D, et al. Rapid identification, capsular typing and molecular characterization of Streptococcus pneumoniae by using whole genome nanopore sequencing[J]. BMC Microbiol, 2020, 20(1)：347
[42] CROUCHER NJ, FINKELSTEIN JA, PELTON SI, et al. Population genomics of postvaccine changes in pneumococcal epidemiology[J]. Nat Genet, 2013, 45(6)：656
[43] LI L, ZHOU J, LI M, et al. Comparative genomic analysis of Streptococcus pneumoniae strains: penicillin nonsusceptible multidrugresistant serotype 19A isolates[J]. Curr Microbiol, 2022, 79(2)：49
[44] NAKANO S, FUJISAWA T, CHANG B, et al. Wholegenome analysisbased phylogeographic investigation of Streptococcus pneumoniae serotype 19A sequence type 320 isolates in Japan[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2022, 66(2)：e0139521
[45] ROCKETT RJ, OFTADEH S, BACHMANN NL, et al. Genomewide analysis of Streptococcus pneumoniae serogroup 19 in the decade after the introduction of pneumococcal conjugate vaccines in Australia[J]. Sci Rep, 2018, 8(1): 16969
[46] YAN Z, CUI Y, HUANG X, et al. Molecular Characterization based on wholegenome sequencing of Streptococcus pneumoniae in children living in southwest China during 20172019[J]. Front Cell Infect Microbiol,2021, 11：726740
[47] GAGETTI P, LO SW, HAWKINS PA, et al. Population genetic structure, serotype distribution and antibiotic resistance of Streptococcus pneumonia causing invasive disease in children in Argentina[J]. Microb Genom, 2021, 7(9)：000636
[48] CUPPONE AM, COLOMBINI L, FOX V, et al. Complete genome sequence of Streptococcus pneumoniae strain Rx1, a Hex mismatch repair deficient standard transformation recipient[J]. Microbiol Resour Announc, 2021, 10(41)：e0079921
來(lái)源：中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)
