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本文主要介紹了北京熱景生物技術股份有限公司研發的醫療器械“乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）”的臨床前研發實驗。

一、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）產品的主要組成成分

本試劑盒由A盒（磁珠法核酸提取試劑）和B盒（擴增反應試劑）組成，主要組成成分見表1。

表1 試劑盒主要組成成分

具體內容詳見產品說明書。 

二、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）產品的預期用途

本試劑盒用于體外定量測定人血清樣本中的乙型肝炎病毒RNA（HBV-RNA）。已有研究數據顯示，外周血血清中 HBV-RNA 可反映肝內HBV病毒的轉錄活性，在部分血清中HBV DNA 低于檢測下限的樣本中，HBV-RNA 仍可以被檢測到。同時，在NAs治療中，血清HBV-RNA可輔助作為HBeAg轉陰的預測的指標之一，血清HBV-RNA結果為陰性，需要結合其他指標共同用于指導NAs的治療。該檢測結果不得作為患者病情評價的唯一指標，必須結合患者臨床表現和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。本試劑盒不得用于HBV的血液篩查。

三、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）產品的產品包裝規格 

48人份/盒。

四、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）產品的檢驗原理

本試劑盒（PCR-熒光探針法）采用磁珠法提取血清中的HBV-RNA。特異性地檢測 HBV-RNA的保守區域。檢測試劑內含有一條反轉錄引物、一對特異性擴增引物以及一條熒光探針，與RT-PCR反應緩沖液，Taq酶，逆轉錄酶等共同配制成RT-PCR反應液，在實時熒光定量 PCR 儀上進行一步法RT-PCR擴增，實現對血清樣本中 HBV-RNA的檢測。

五、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）產品的主要原材料的選擇

本產品的主要原材料包括：引物、探針、假病毒、RT PCR反應體系（包括10×RT-PCR Buffer（含dNTPs）、逆轉錄酶和TaqDNA聚合酶混合液）、磁珠法核酸提取試劑等，這些原材料均是通過外購方式獲得。其中，引物和探針均為熱景生物自行設計，由專業的合成公司合成和純化后獲得。 

熱景生物從有資質的供應商中，通過功能性試驗，篩選出最佳原材料和供應商。制定了各主要原材料質量標準并經檢驗合格。

六、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）產品的企業參考品設置情況

該產品企業參考品包括陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品、檢出限參考品、準確度參考品、樣本線性參考品、核酸提取功能參考品，參考品采用臨床樣本制備而成。

組成如下：

陽性參考品共10份，分別命名為陽性參考品P1~P10，來源于HBV-RNA陽性樣本，涵蓋B型、C型和D型。

陰性參考品共10份，分別命名為陰性參考品N1~N10，涵蓋正常人樣本、巨細胞病毒、EB病毒、人類免疫缺陷病毒1型、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒和梅毒樣本。

精密度參考品共2份，分別命名為精密度參考品J1~J2，采用HBV-RNA陽性樣本梯度稀釋而成。

檢出限參考品1份，命名為檢出限參考品S1，采用HBV RNA陽性樣本稀釋而成，濃度為300copies/mL 。

準確度參考品共5份，分別命名為準確度參考品Y1~Y5，采用HBV-RNA陽性樣本梯度稀釋而成，濃度分別為2.0×107 copies/mL、2.0×106 copies/mL、2.0×105 copies/mL、2.0×104 copies/mL、2.0×103 copies/mL。 

樣本線性參考品1份，命名為樣本線性參考品L，采用HBV-RNA陽性樣本稀釋而成。

核酸提取功能參考品共 12 份，分別命名為核酸提取功能參考品T1~T12，其中T1~T8采用含內源性干擾物質的HBV RNA陽性樣本稀釋而成，T1、T5、T9含血紅蛋白，T2、T6、T10含甘油三脂，T3、T7、T11含總IgG，T4、T8、T12含總膽紅素，T9~T12為陰性血清樣本。

以上臨床樣本采用數字PCR法和實時熒光PCR法進行確認。各企業參考品用于產品準確性、特異性、檢出限、精密度、線性、核酸提取功能等的檢測。

本試劑盒設置了陽性質控品和陰性質控品，用于檢測過程中試劑盒和儀器的質量控制。此外，每個樣本均檢測1個內標，用于評估核酸提取和PCR擴增的質量和結果的判讀。

七、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）產品的生產工藝及反應體系研究 

熱景生物對試劑盒反應體系的研究包括對HBV-RNA特異性引物/探針濃度的確定、內標引物/探針濃度的確定、反應液的選擇、反應體積的確定、核酸提取試劑的確定、DNA酶I的用量確定等；對反應條件的研究包括PCR退火溫度、擴增循環數、擴增反應時間，DNA 酶 I 的作用溫度和時間的篩選和優化；對樣本用量、內標用量、核酸提取液體積等進行了研究。

熱景生物通過功能性實驗，確定了最佳的反應體系。并根據試劑盒中試劑及組件的主要生產工藝的研究結果，確定了最佳的生產工藝。

八、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）產品的的分析性能評估研究

該產品分析性能評估內容包括核酸提取功能、檢出限、線性范圍、準確度、精密度、分析特異性（交叉反應、干擾物質）、HBV DNA 干擾濃度等。熱景生物提交了有效運行的質量管理體系下生產的三批產品在3種適用機型（ABI Prism7500、LightCycler480、杭州博日 9600plus）上的性能評估資料。

在核酸提取功能評估中，熱景生物使用含有28mg/dL總膽紅素、22g/dL血紅蛋白、3000mg/dL甘油三酯、40g/L總IgG的HBV-RNA陰性血清樣本稀釋已知濃度的HBV-RNA強陽性樣本，制備成高、低濃度樣本進行研究，結果表明以上干 

擾物質對核酸提取性能無影響。

在檢出限的性能評估中，熱景生物對HBV-RNA臨床血清樣本（B型、C型、D型）和HBV-RNA假病毒樣本（A型、E型、F型、G型）進行梯度稀釋，采用三批次試劑對系列濃度樣本分別進行20次重復檢測，以≥95%陽性檢出率的最低稀釋濃度作為檢出限，最終確定該產品檢出限為300copies/mL。采用三批試劑對HBV-RNA臨床血清樣本（B型、C型、D型）和HBV-RNA假病毒樣本（A型、E型、F型、G型）進行檢出限的重復性檢測驗證，符合檢出限的性能要求。

在線性范圍的性能評估中，熱景生物采用不同基因型的樣本，分別制備9個濃度的樣本進行線性范圍研究，產品在1.0×103 copies/mL~1.0×108 copies/mL范圍濃度呈線性相關，線性相關系數 r＞0.9800，符合線性范圍的性能要求。

在準確度的性能評估中，熱景生物采用 HBV-RNA 陰性樣本 

對陽性樣本進行系列稀釋，分別制備成2.0×107 copies/mL、2.0 × 106 copies/mL、2.0 × 105 copies/mL、2.0 × 104 copies/mL、2.0×103 copies/mL共5個梯度樣本進行準確度研究，結果表明檢測濃度的對數值與理論濃度的對數值的絕對偏差不超過±0.5 個對數數量級，符合準確度的性能要求。

在精密度的性能評估中，熱景生物對高、中2個濃度的HBV RNA精密度樣本進行檢測，分別對批內、批間檢測結果進行分析，結果表明精密度樣本的變異系數均不高于5%，符合精密度的性能要求。

分析特異性研究包含交叉反應和干擾研究。交叉反應的性能評估中，熱景生物對人巨細胞病毒、EB 病毒、人類免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、梅毒、人類皰疹病毒 6 型、單純皰疹病毒 1 型、單純皰疹病毒 2 型、甲型流 

感病毒、丙酸痤瘡桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌樣本進行交叉反應評價。結果顯示，上述樣本與本產品均不產生交叉反應。

干擾研究實驗中，熱景生物采用在中低濃度的 HBV-RNA 樣 本中加入干擾物質的方法進行驗證，拉米夫定（1.3μg/mL）、 阿德福韋酯（21.24ng/mL）、恩替卡韋（3.46μg/mL）、替比夫定（3.69μg/mL）、普通 IFNα（2020pg/mL）、聚乙二醇干擾素α（10.88μg/L）、總膽紅素（≤28mg/dL）、甘油三酯（≤3000mg/dL）、血紅蛋白（≤22g/dL）、總 IgG（≤40g/L）及不高于 2×107 IU/mL 的 HBV DNA 對本產品檢測結果均不產生干擾。

九、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）產品的陽性判斷值或參考區間研究

本產品的陽性判斷值研究，采用乙肝感染者的血清樣本（B 型、C 型、D 型）及不同人的陰性血清樣本共 249 例，使用本試劑盒進行陽性判斷值研究，對檢測靶標 Ct 值進行ROC 分析，確定其陽性判斷值為靶標 Ct≤26。通過對 HBV DNA 陽性/陰性、HBsAg 陽性/陰性及 HBeAg 陽性/陰性樣本的 靶標進行 Ct 值分析，HBV DNA 陽性/陰性、HBsAg 陽性/陰性 及 HBeAg 陽性/陰性對靶標陽性判斷值的判定無影響。

本產品預測HBeAg轉陰的陽性判斷值研究，采用79例慢性HBV感染者（B型、C型、D型）隊列血清樣本（0周、48周、5年），使用本試劑盒進行檢測，對檢測結果分別計算 B、C、D 型的 ROC 曲線和最佳預測 cutoff 值，結果顯示 

均不具有顯著差異；將 B 型、C 型、D 型樣本合并共同用于確定預測治療 5 年后 e 抗原轉陰的最佳 cutoff 值為708copies/mL。此時的 PPV 為 81.8%，NPV 為 87.0%。

十、乙型肝炎病毒 RNA（HBV-RNA）測定試劑盒（PCR-熒光探針法）產品的穩定性研究

熱景生物對本產品的實時穩定性、開瓶及凍融次數限度穩定性、運輸穩定性進行了研究，同時，對樣本的穩定性也進行了研究，確定了在各種條件下本產品及樣本的有效保存時間。

實時穩定性：將三批次試劑的 A 盒置于 10~30℃，B 盒置于-20 ± 5℃的條件下保存，連續 7 個月對試劑盒的外觀、陰陽性符合率、檢出限、線性、準確度、精密度進行考察，各項性能指標均符合要求，確定產品在規定的儲存條件 下，可穩定保存 6 個月。 

此外，熱景生物對產品的開瓶及凍融次數限度穩定性、運輸穩定性和樣本穩定性分別進行了研究。結果顯示，產品的性能均滿足產品說明書聲稱的要求。