不溶性微粒指不溶于水和有機溶劑，非代謝性的，肉眼所看不見的顆粒物。不溶性微粒粒徑一般小于50μm的微粒，可見異物指在特定條件下目視即可觀測到的不溶性物質，其粒徑或長度通常大于50μm。可見異物/不溶性微粒的控制是保證注射劑安全使用的一項重要指標。對于生物制品注射劑而言，蛋白質產品中的蛋白質有聚集并形成不溶性微粒的傾向，且這種聚集會影響藥效，增加潛在的免疫原性風險。因此，不溶性微粒/可見異物是生物注射劑的關鍵質量屬性之一。本文對生物制劑中不溶性微粒/可見異物產生原因、檢測方法和控制策略進行分析，以期為生物注射劑研發提供參考。
1. 產生原因
1.1外源污染
如原輔包中未清除的金屬屑、玻璃屑、纖毛、塊狀物等，設備清潔不當，人員、環境中帶來的一些顆粒等。
1.2制劑降解
制劑儲存期間產生不溶性微粒/可見異物，例如，氧化、水解，高溫引起活性藥物成分與輔料相互作用，藥物包材相互作用產生的可浸出物，包材中硅油的脫落等。
1.3界面應力
界面應力可以發生在所有界面，例如，在含有硅油作為潤滑劑的樣品的液-液界面，如預填充注射器，蛋白質可以聚集在油滴表面。在溶液和頂空交界面的靜脈液袋中，蛋白質在液-氣界面上聚集，儲存或樣品凍融時在固液界面聚集等。
1.4聚山梨酸酯降解
處方中通常添加表面活性劑以保護蛋白質免受界面應力的影響。最常用的表面活性劑包括聚山梨酸酯20和聚山梨酸酯80以及波洛沙姆188。聚山梨酯是一種非離子表面活性劑，由于多種不同的脂肪酸作為側鏈存在，聚山梨酯的組成是高度不均勻的。已知聚山梨酸酯可以通過水解和/或氧化降解，產生不同的不溶性降解產物，導致不溶性微粒/可見異物產生。此外，酶水解被認為是在抗體藥物中聚山梨酯降解導致蛋白聚體微粒形成的根本原因。一些脂肪酶、酯酶、宿主細胞蛋白殘留磷脂酶 B2 都可以在酯鍵處裂解聚山梨酯，從而形成游離脂肪酸，由于游離脂肪酸在水溶液中溶解度差，當低溫保存時，制劑中形成不溶性微粒/可見異物，對其蛋白質的長期穩定性產生一定影響，從而影響藥品的有效期。
2. 檢測方法：
2.1不溶性微粒檢查法
《中國藥典》2020 年版三部采用光阻法和顯微計數法。USP<1787>建議使用4-100μm粒徑范圍內的形態測量，這可能有助于區分粒子來源為固有的、內在的/外在的，以降低不溶性微粒帶來的風險。但由于其檢測原理，無法區分不同類型的顆粒，例如蛋白質聚集體、硅油液滴等。此外可能無法檢測到半透明的蛋白質聚集體，從而低估了樣品中的總顆粒。近年來流行的流式成像顯微鏡(FIM)技術通過使用直接對顆粒進行成像的FIM不僅可以獲得形態信息還能夠將蛋白質聚集體與其他顆粒（如硅油滴、氣泡和其他外在和內在的顆粒雜質）區分開來。
2.2 可見異物檢查法
《中國藥典》2020 年版三部采用燈檢法和光散射法。然而，除了大小之外，可見性的限制還取決于許多因素包括顏色、形狀、透明度、反射率以及檢測人員的培訓。要想了解粒子具體類型通常需要將他們分離后進行表征。任何一種分離方法都應注意需要去除干擾(例如，用水沖洗樣品的可溶性賦形劑)。物理方法包括顯微表征和成像方法。化學鑒定通常涉及光譜技術，如傅里葉變換紅外(FTIR)和拉曼光譜，它們適用于識別有機材料，如彈性體，纖維和產品相關顆粒(蛋白質，輔料)。這些都有助于確定顆粒來源、引入途徑。
3. 控制策略
3.1 早期開發階段
充分了解藥物的相關性質，評估可能產生的顆粒類型。如表面活性劑聚山梨酸酯20和聚山梨酸酯80降解產生顆粒，可以選擇純度較高的聚山梨酸酯，盡量減少降解脂肪酸的產生。包材方面，硅油的存在可能會促進顆粒產生，應充分評估考察硅油的用量對產品的影響。必要時可以選擇無硅油的產品。工藝優化，選擇合適的凍干工藝，盡量避免冷凍應力導致的蛋白聚集。
有些情況下，顆粒的產生是不可避免的，一些上市生物制品中就申稱含有一些顆粒。如Bristol-Myers Squibb公司生產的Erbitux®可能含有少量易見、白色、無定形的西妥昔單抗顆粒。Amgen公司生產的Vectibix®可能含有可見的半透明到白色，無定形的蛋白質顆粒。
這種情況下就需要對粒子進行鑒別，評估產生的數量和尺寸，并進行毒理學和安全性評估，以確定不會對患者產生安全性的影響。
3.2 生產過程中控制
應關注產品生產線上可能帶來的異物，如對包材清洗進行驗證，環境監測，人員培訓。評估藥液在生產轉移過程中界面應力的影響，如對攪拌速度、灌裝速度進行合理的控制。檢測灌裝或裝配線中的故障，如玻璃破裂或漏油。在生產后，每批產品都要進行100%密封性檢驗，及時發現外觀缺陷，剔除不合格產品。
3.3 穩定性研究
大多數固有的粒子現象產生于穩定性階段，可以通過影響因素加速試驗及早發現粒子的產生情況。在整個穩定性研究期間按照藥典要求進行可見異物和不溶性微粒的監控，并進行趨勢分析。對超出藥典標準要求的顆粒進行表征，確定顆粒來源和控制措施。依據穩定性研究數據確定產品儲存的條件和包材的相容性，為產品有效期制定提供依據。關注使用中穩定性，特別是需要進一步稀釋的產品，由于表面活性劑濃度的降低和一些操作產生的界面應力會導致使用過程中顆粒的產生。凍融應力也可能會導致顆粒的增加。模擬運輸試驗，評估運輸過程對顆粒的影響。
3.4 上市后監控
產品上市持續監控對于確定開發階段制定的質量標準非常重要。任何在生產過程中引入的變化(例如，配方變化、包材的變更等)應徹底評估其對顆粒形成的影響。此外，在研發階段發現顆粒的情況下，上市后批次應密切觀察，以檢測與研發批次之間的差異。同時，通過上市后大批量的使用人群，進一步評估產品的安全性。
總結：
綜上所述，生物注射劑在產品開發設計階段就應充分評估可能產生不溶性微粒/可見異物的因素。生產過程中盡量避免外來異物的污染。通過穩定性研究發現儲存期間和使用過程中可能產生的不溶性微粒/可見異物。上市后持續監測，及早發現上市產品與研發產品的差異。一旦發現了超過標準的不溶性微粒/可見異物需要進一步檢測分析顆粒類型及來源，制定合理的控制策略。對于無法避免的產品固有不溶性微粒/可見異物需要進行毒理評估產品安全性，并在臨床中持續觀察產品對人體安全性的影響。
近年來，各種新型生物藥的開發火熱，如LNP，細胞治療藥物等本身就具有顆粒的性質，如何區分藥物顆粒、蛋白聚集、外來異物給不溶性微粒/可見異物檢測帶來了挑戰。隨著檢測技術的發展，AI智能算法等先進的檢測技術可以更好的對不溶性的來源進行分類和整理，為快速鑒別顆粒，加快生物產品的研發提供了助力。
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