繪制中樞神經系統的長期穩(wěn)定活動圖對于神經科學、解決神經系統疾病以及開發(fā)用于神經義肢和通信的高帶寬腦機接口都非常重要。然而，繪制神經活動圖具有挑戰(zhàn)性，因為中樞神經系統的功能不僅在數月或數年內跨越多個區(qū)域和組織深度，而且還涉及需要在毫秒和微米尺度上量化單個神經元的電活動。在現有技術中，植入式微電極陣列可同時測量數千個單個神經元的毫秒級細胞外動作電位。通過3D堆疊或集成 CMOS（互補金屬氧化物半導體）多路復用電路，可進一步增加電極數量。然而，由于植入電極與腦組織之間存在巨大的機械和結構差異，探針漂移、慢性組織損傷和免疫反應限制了它們在長期穩(wěn)定記錄同一神經元電活動方面的時間擴展性。記錄神經系統中神經活動的電子設備需要在大空間和時間尺度上具有可擴展性，同時還要提供毫秒級和單細胞的時空分辨率。然而，由于傳感器密度和機械靈活性之間的權衡，現有的高分辨率神經記錄設備無法同時實現空間和時間層面的可擴展性。
來自美國哈佛大學的劉嘉團隊開發(fā)了一種基于全氟介電彈性體和組織級的具有柔性多層電極的3D堆疊植入式電子平臺，它能在神經系統中實現時空可擴展的單細胞神經電生理學。本研究的彈性體在生理溶液中可保持一年以上的穩(wěn)定介電性能，其柔軟度是傳統塑料介電材料的 10,000 倍。利用這些獨特的特性，本研究開發(fā)出了以3D配置封裝光刻納米厚電極陣列的方法，其橫截面密度為每 100 µm2 7.6 個電極。由此產生的3D集成多層軟電極陣列保持了組織級的靈活性，減少了小鼠神經組織中的慢性免疫反應，并證明有能力在不干擾動物行為的情況下可靠地跟蹤小鼠大腦或脊髓中長達數月的電活動。相關工作以題為“3D spatiotemporally scalable in vivo neural probes based on fluorinated elastomers”的文章發(fā)表在2023年12月22日的國際頂級期刊《Nature Nanotechnology》。
【通訊作者簡介】
哈佛大學劉嘉課題組的目標是通過各種尺度將電子學與生物學結合起來。為了實現這一目標，本課題組匯集了生物工程、電子工程、化學、生物信息學、計算機科學以及材料科學和機械工程等領域的專家，利用納米電子學、軟材料和基因工程與半導體工業(yè)兼容的光刻技術相結合，開發(fā)可擴展的生物電子學平臺技術。課題組的目標是將這些可擴展的生物電子技術與機械人工程、單細胞基因組學、成像和計算分析相結合，將電子學與生物學無縫結合，將機器智能與自然智能融為一體。利用這一平臺技術，本課題組開發(fā)出能夠跟蹤和控制活生物體和行為動物體內單個細胞多模式活動的工具，這些活動具有細胞類型特異性，可跨時間和空間對大量細胞進行統計。利用本課題組專業(yè)的實驗和計算知識，旨在了解單細胞多模式生理學和基因表達的群體動態(tài)與整個器官和生物體的功能和功能障礙之間的關系。本課題組的研究涉及腦機接口、神經工程、干細胞工程、心臟疾病和發(fā)育障礙等領域的問題。2022年，劉嘉入選《麻省理工科技評論》“35歲以下科技創(chuàng)新35人”全球榜單。
1. 創(chuàng)新型研究內容
本研究通過3D集成薄膜組織級軟微電極陣列（圖 1b），推出了一種時空可擴展的神經探針（圖 1a）。本研究克服了軟介電彈性體在生理溶液中作為鈍化層的內在不穩(wěn)定性，使用了具有高疏水和低分子溶解度的含氟彈性體，這大大減少了來自周圍生物流體的離子擴散，從而實現了在生物流體中長期穩(wěn)定的介電性能。具體來說，本研究開發(fā)了一種基于全氟聚醚 (PFPE) 的彈性體，作為一種彈性光圖案介電材料。這種基于全氟聚醚（PFPE）的光圖案介電材料（1）比傳統的硬塑料封裝材料柔軟 10,000 倍，同時保持相同水平的縱向介電性能；（2）能夠進行微米分辨率的3D光刻多層納米制造；（3）與納米級厚度的金屬沉積工藝相兼容。3D堆疊微電極陣列可以通過3D堆疊增加電極的數量和密度，同時保持組織級的靈活性和機械堅固性，并能在數月內以單機-單尖峰分辨率穩(wěn)定跟蹤電活動，同時減少免疫反應，這證明了其在神經電生理學的空間和時間尺度上的可擴展性（圖 1c）。
本研究的設計基于以下理由。在不改變探針柔性特性的前提下增加電極密度的方法之一是大幅縮小互連尺寸。然而，這會帶來串擾和信號衰減等挑戰(zhàn)。另一種方法是使用薄膜晶體管進行現場多路復用以增加電極密度，但其機械剛性和在生理溶液中需要較厚的無機鈍化層限制了其在組織級柔性神經探針中的應用潛力。第三種方法是通過垂直堆疊3D電極陣列來增加電極密度（圖 1d），但這需要采用低模量電子材料來保持整體靈活性。
圖1 用于時空可擴展體內電生理學的植入式神經探針
【生物流體中長期穩(wěn)定的軟封裝】
傳統的介電彈性體可用作生物電子學的軟封裝材料；然而，由于生理溶液中的離子會逐漸滲透到彈性體中，它們的長期封裝性能受到了限制（圖 1h,i）。本研究團隊之前的研究表明，它們的電化學阻抗在生物液體中會急劇下降，從而降低封裝電極的截止頻率。這種不穩(wěn)定性主要是由生物流體中的離子擴散到彈性體中造成的（圖 2a），因為軟聚合物的分子滲透性通常比塑料和無機物的分子滲透性高幾個數量級。聚合物的離子傳導性與其擴散性和溶解性成正比。本研究利用分子動力學（MD）模擬研究了水和氯化鈉在不同介電彈性體中的擴散，以更好地理解這一離子擴散過程，并確定可能解決這一問題的材料系統。本研究的 MD 模擬顯示，在 37℃時，含氟彈性體（PFPE-DMA 和 PHFIPA）中水、鈉離子和氯離子的分子擴散率低于傳統彈性體（PDMS 和 H-SEBS）（圖 2b）。這種較低的擴散率表明，含氟彈性體的離子傳導率可能低于傳統彈性體，這可能使它們在生理溶液中長期浸泡時保持介電性能。為了驗證這一假設，本研究系統分析了八種不同介電材料的長期電化學穩(wěn)定性，其中包括三種含氟彈性體（PFPE-DMA、PHFIPA 和聚[2-(全氟己基)乙基]丙烯酸酯 (PPFHEA)）、三種非含氟彈性體（PDMS、H-SEBS 和聚異丁烯 (PIB)）以及作為對照的兩種塑料介電聚合物（聚酰亞胺 (PI) 和 SU-8 2000.5 (SU-8)）。
本研究使用電化學阻抗光譜（EIS）和外部電解質電導測量（EEC）技術評估了介電聚合物的離子電導率（圖 2c）。本研究使用具有導電損耗的電介質材料電學模型，根據 EIS 數據估算離子電導率。為了進行加速老化試驗，本研究將聚合物薄膜浸泡在 10 倍 PBS 溶液中，溫度為 70℃。浸泡前后歸一化電化學阻抗 (Z) 的 Bode 圖顯示，在 0-1,000 Hz 范圍內，傳統彈性體和 PI 薄膜的阻抗大幅降低，而 SU-8 和含氟彈性體薄膜的阻抗則略有降低。在低頻（<1,000 赫茲）下，所有含氟彈性體薄膜的阻抗模量降幅都低于 PDMS、H-SEBS、PIB 和 PI 薄膜。為了考慮由于樣品厚度不同而導致的擴散時間變化，本研究繪制了 1 Hz 和 1 kHz 時阻抗模量的逐漸減小曲線（圖 2d），作為時間（t）與聚合物薄膜平均厚度（H）平方的歸一化函數。在 1 Hz 時，非氟化彈性體的歸一化阻抗下降幅度更大。此外，本研究還從 EIS 圖中推斷出介質薄膜在 1,000-100,000 Hz 頻率范圍內的平均介電常數，證實 PFPE-DMA 的介電常數較低（ε = 1.99 ± 0.03），與之前的報告一致。
圖2 作為軟性長壽命電介質的氟化彈性體
【3D可擴展神經探針】
本研究開發(fā)了一種使用全氟聚醚-DMA 彈性體的3D光刻技術，并且將其用于可擴展的神經探針制造。傳統的彈性體不適合多層光刻技術，因為在此過程中使用的有機溶劑容易導致彈性體膨脹，從而損壞薄膜微結構和微電子元件。然而，PFPE-DMA 彈性體已顯示出化學正交性，既能抵抗有機溶劑，也能抵抗水性溶劑，即使在密集的納米加工后仍能保持其表面。然而，與其他傳統光圖案化介電材料的高接觸角以及與金屬的低表面粘附能阻礙了在 PFPE-DMA 彈性體上直接圖案化金屬。此外，交聯過程中對氧氣的敏感性也限制了基于掩模的 PFPE-DMA 彈性體光刻圖案的分辨率。
為了克服這些挑戰(zhàn)，本研究開發(fā)了以下先進技術：(1)可3D打印的氮氣擴散器與傳統光刻機集成，在紫外線（UV）照射期間形成惰性氣氛，從而實現 PFPE-DMA 的微尺度光刻；(2) 光刻隔板可防止 PFPE-DMA 前驅體與光罩直接接觸，從而在光刻過程中保持 PFPE-DMA 薄膜的納米級平滑度；（3）用惰性氣體等離子體處理，以減小光刻膠的接觸角，增加與其他材料的附著力；以及（4）高壓濺射金屬氧化物/金屬層，以沉積金屬線，防止金屬離子擴散到 PFPE-DMA 中。可以重復(1)-(4)工序來制造多層微電子結構。重要的是，這些創(chuàng)新技術使 PFPE-DMA 能夠在標準潔凈室中作為負光刻電介質材料進行加工，從而使 PFPE-DMA 成為一種可與 3D 電子產品的傳統光刻工藝兼容的彈性體（圖 3a）。
圖 3b 顯示了玻璃毛細管上帶有 64 個電極的神經探針的靈活性。相應的明場（BF）光學圖像顯示一個探針包含六層 PFPE-DMA 夾層四層金屬電極（圖 3c、d）。掃描電子顯微鏡（SEM）成像用于確認十層制造工藝后 PFPE-DMA 介電層的光滑表面。本研究對 PFPE-DMA 特征的橫向分辨率達到了約 1 µm，表面處理使標準光刻膠能夠在 PFPE-DMA 薄膜上確定精確的特征。值得注意的是，即使單軸拉伸到 20%，PFPE-DMA 和金屬層之間也沒有分層（圖 3e）。粘附測試表明，PFPE-DMA 層的自粘附能大大高于其與玻璃基底的粘附能，并且更接近于所測得的固有斷裂韌性，這表明兩個 PFPE-DMA 層粘附牢固，在應變下不易分層。在單軸拉伸大于 20% 后，64 通道四金屬層神經探針上未觀察到層間分層現象。此外，在生理鹽水中加速老化也不會誘發(fā)全氟聚醚-DMA 和金屬層之間的分層。
圖3 3D集成高密度軟微電極陣列，實現可擴展的神經探針
【長期穩(wěn)定的神經電生理學】
本研究將神經探針植入小鼠大腦進行長期記錄。軟神經探針是按照傳統的方法送入大腦的。PFPE-DMA 探針垂直整合了四層電極陣列，橫截面積約為超柔性探針的 150-500 倍，因此可以在一個探針中高密度植入 64 個電極（圖 4a）。本研究比較了多層 PFPE-DMA 探針和相同厚度的 SU-8 探針的腦免疫反應（圖 4b、c）。在植入后 12 周，觀察到與 SU-8 探頭相比，PFPE-DMA 探頭周圍的 NeuN（神經元）信號明顯增強。此外，與 SU-8 探針相比，植入后 12 周 PFPE-DMA 探針周圍的星形膠質細胞和小膠質細胞的熒光強度明顯降低。然而，小膠質細胞信號的差異微乎其微。這些結果表明，3D垂直堆疊多層 PFPE-DMA 探針能與腦組織保持長期的生物相容性。慢性記錄（圖 4d、e）顯示，在十周的植入期內，單個單元動作電位的記錄非常穩(wěn)定，棘間期（ISI）分布（圖 4f）和波形形狀（圖 4g）的變化極小。此外，主成分分析（PCA）顯示，從植入后兩周到十周，所有單元在第一和第二主成分平面（PC1-PC2）上的位置幾乎保持不變（圖 4h）。此外，振幅、點燃率和波形相似性在所有記錄過程中都保持不變，這表明高密度多層軟探針可以長期穩(wěn)定地跟蹤來自相同神經元的活動（圖 4-i-k）。本研究還使用帶有單層電極陣列（約 2 微米厚的 PFPE-DMA）的 PFPE-DMA 探頭證實了腦記錄的穩(wěn)定性，從而進一步驗證了超薄 PFPE-DMA 封裝層在長期腦記錄過程中的介電穩(wěn)定性。
圖4 通過可擴展的軟神經探針實現長期穩(wěn)定的腦電生理和植入，同時減少免疫反應
PFPE-DMA 介電層的可拉伸性使多層神經探針能夠承受更大的應變，在彎曲過程中對組織造成的機械損傷更小。為了證明這一點，本研究對小鼠脊髓進行了慢性電生理學研究（圖 5a）。首先比較了 PFPE-DMA 和 PI 探針與假手術對照組的免疫反應，從而確定了長期免疫反應的特征（方法）。厚度為 25 μm 的 PI 探針被用作柔性脊髓植入物的標準探針，其堅固程度足以承受手術過程和長期植入。假手術組動物接受脊髓手術，但未植入裝置。通過檢測異物反應的星形膠質細胞（GFAP）和小膠質細胞（IBA1）的密度來評估慢性階段的神經炎癥反應，結果顯示，在植入后六周，PI 探針附近的星形膠質細胞和小膠質細胞密度增加。相比之下，植入 PFPE-DMA 探針的小鼠與假手術動物沒有明顯差異（圖 5b、c）。
本研究通過測量小鼠在開闊地箱中的自由移動以及在水平梯子上基本行走和熟練運動時的全身運動情況，確定了植入探針對動物行為的影響（圖 5d）。統計結果表明，與假對照組相比，植入 PI 探針的小鼠在運動過程中的平均距離和平均速度都有所減少，同時還出現了運動障礙，而植入 PFPE-DMA 探針的小鼠則沒有明顯差異（圖 5e）。利用植入的電極，本研究記錄了幾周內來自代表性電極的尖峰樣電活動（圖 5f），其發(fā)射率的變化與動物的靜息和行走狀態(tài)相對應（圖 5g、h）。觀察到的尖峰表現為持續(xù)時間延長（2-4 毫秒）和振幅增大（250-500 微伏）。這種現象以前在小鼠脊髓深度探針記錄中也曾出現過。然而，要確定這些尖峰是多單位動作電位還是局部場電位，還需要進一步研究。這些結果表明，植入小鼠脊髓的 PFPE-DMA 軟神經探針不會影響動物的行為，并能穩(wěn)定記錄脊髓電活動。
圖5 長期穩(wěn)定的脊髓記錄
2. 總結與展望
本研究表明，可以用四層氟化彈性體/金屬結構制作神經探針。基于歐拉-伯努利梁理論的分析模型顯示，多達九層的探針彎曲剛度低于 1 µN m，而由塑料電介質封裝的探針只有三層電極，彎曲剛度高于 1 µN m。在實踐中，厚度超過 10 微米的塑料探針會變脆，而由彈性體封裝的探針在植入時則會保持柔韌性和堅固性。研究表明，與薄的硬塑料探針相比，橫截面更大的超軟神經探針可實現長期穩(wěn)定的神經記錄。這些超軟探針可以支持更多通道。本研究發(fā)現，金層和全氟聚醚-DMA 層之間的極度模量不匹配可能會導致中性軸的分裂，從而降低彎曲剛度。不過，基于以前工作的分析模型表明，歐拉-伯努利理論仍然適用于探針的大部分長度。實際上，擴展這些探針的主要限制可能來自微加工方面的挑戰(zhàn)。當介質層的彈性模量低于兆帕斯卡水平時，它對探針總撓曲剛度的貢獻微乎其微，金屬層在探針的機械性能中占主導地位。因此，隨著層數的增加，優(yōu)勢也會逐漸減少，因為離中軸較遠的金屬層對探針撓曲剛度的貢獻更大。為了降低這種剛性，可以考慮采取一些策略，例如調整金屬層的位置、增加外層彈性體厚度以防止信號泄漏或使用液態(tài)金屬等較軟的導體。
文章來源：
https://www.nature.com/articles/s41565-023-01545-6
https://liulab.seas.harvard.edu/
