您當前的位置：檢測資訊 > 科研開發(fā)
嘉峪檢測網(wǎng) 2024-02-18 09:57
黑色素瘤是一種產(chǎn)生于黑色素細胞的惡性皮膚腫瘤，易轉(zhuǎn)移，侵襲性強，存活率低。因此，一種簡單、可行、高效的治療策略仍是該領(lǐng)域的一項艱巨挑戰(zhàn)。最近，智能可穿戴生物貼片通過外部刺激引發(fā)不可逆的腫瘤細胞損傷，為皮膚腫瘤治療提供了一種前景廣闊的輔助方法。迄今為止，已開發(fā)出多種用于皮膚腫瘤治療的自供電電貼片和基于焦耳熱的熱療貼片。然而，大多數(shù)已報道的電熱貼結(jié)構(gòu)復雜、制作工藝復雜、設備要求高、制備難度大，因此制備成本高、耗時長。這些缺點限制了其潛在的臨床應用，因此迫切需要開發(fā)一種簡單、多反應和可穿戴的貼片來有效治療黑色素瘤。一種能夠?qū)夂碗姰a(chǎn)生多種反應而又不影響日常活動的可穿戴生物貼片是皮膚癌治療的殷切希望，但仍是一項關(guān)鍵挑戰(zhàn)。
來自中國科學院長春應用化學研究所的Guohua Qi和金永東團隊開發(fā)了由透明離子凝膠和摻雜 MXene（Ti3C2Tx）組成的可安裝在皮膚上的電刺激增強型光熱貼片（eT-patch），并將其應用于 0.5 W/cm2 光刺激下的黑色素瘤治療。由于摻雜了 MXene 的離子凝膠具有很高的光熱轉(zhuǎn)換效率和作為介質(zhì)的導電性，因此所設計的 eT 補丁具有優(yōu)異的光熱和導電特性。同時，基于離子凝膠的 eT 貼片具有極佳的光學透明度，可在光熱和電刺激（PES）聯(lián)合療法下實時觀察皮膚反應和黑色素瘤治療過程。通過系統(tǒng)的細胞研究發(fā)現(xiàn)，在光熱電刺激治療下，eT-patch 能協(xié)同觸發(fā)癌細胞凋亡和熱休克，共同導致黑色素瘤細胞死亡。所開發(fā)的 eT-patch 具有相對安全、對健康器官副作用小等明顯優(yōu)勢，為皮膚腫瘤提供了一種經(jīng)濟有效的治療策略，并將為離子凝膠的生物醫(yī)學應用開辟一條新途徑。相關(guān)工作以題為“A wearable electrostimulation-augmented ionic-gel photothermal patch doped with MXene for skin tumor treatment”的文章發(fā)表在2024年01月26日的國際頂級期刊《Nature Communications》。
1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容
本研究開發(fā)了一種基于透明離子凝膠的可穿戴生物電熱貼片（eT-patch），它摻雜了MXene，具有更好的導電性和光熱特性，可用于生物醫(yī)學應用。所開發(fā)的 eT 貼片具有良好的光學透明性，可在 PTT 和 ES（PES）聯(lián)合治療黑色素瘤的過程中實時觀察治療效果。如圖 1 所示，PES 治療后腫瘤得到了明顯的抑制。本研究從細胞水平揭示了 eT-patch 的抗腫瘤機制。由于PES治療相對安全，對移植黑色素瘤小鼠的主要器官無明顯損傷，eT貼片在皮膚腫瘤治療方面具有潛在的臨床應用前景。
圖1 基于離子凝膠的皮下腫瘤治療電子貼片
【eT-patch 的制備和表征】
首先，在氟化鋰和鹽酸的混合溶液中蝕刻 Ti3AlC2 粉末（MAX），然后離心分離并分散到水中，得到 Ti3C2Tx 的納米片膠體，冷凍干燥后得到 MXene 粉末。如圖 2a、b 所示，以納米孔陣列陽極氧化鋁為載體，通過掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）成像，可以清晰地觀察到樣品的超薄二維層狀結(jié)構(gòu)，表明化學剝離 Ti3C2Tx 納米片的制備成功。如圖 2c 所示，用原子力顯微鏡測量的 Ti3C2Tx 納米片的厚度約為 2 nm，這與之前報道的結(jié)果一致。隨后，利用 X 射線衍射（XRD）測量了 Ti3C2Tx 納米片的晶體結(jié)構(gòu)。如圖 2d 所示，MAX 粉末與 Ti3C2Tx 的 XRD 圖樣中，(002) 峰明顯從 9.5°移至較小的 6.5°角，與 MAX 相關(guān)的 (101)、(104) 和 (105) 三個峰消失了，這是因為 Ti3C2Tx 從 Ti3AlC2 轉(zhuǎn)變而來，實現(xiàn)了插層，并在表面引入了 -O、-OH 和 -F 端基團。
為了進一步了解 Ti3C2Tx 納米片的表面基團，本研究用 X 射線光電子能譜（XPS）對其進行了檢測。納米片的 XPS 光譜顯示了 0 至 1000 eV 范圍內(nèi) Ti2p、C1s、O1s 和 F1s 的典型峰值，這些峰值分別位于 33、284、454、531、563、682、827 和 976 eV。結(jié)果證實制備的納米片表面主要含有-O、-OH 和-F等表面端基。圖 2e顯示了 Ti3C2Tx 納米片的 Ti 2p 光譜，其中 454.3 和 460.5 eV 對應于 Ti-C 鍵。455.5 和 461.6 eV 處的峰主要歸因于 Ti2+，而 Ti3+ 的峰則位于 457.8 和 464.3 eV 處，在 488.8 eV 處沒有檢測到峰，這表明 Ti3C2Tx 納米片在分層過程中沒有發(fā)生氧化。蝕刻得到的 Ti3C2Tx 納米片可以很好地分散在水中，并表現(xiàn)出顯著的廷德爾效應（如圖 2f 插圖所示）。同時，利用紫外吸收光譜檢測了水中膠體 Ti3C2Tx 納米片的光學特性（圖 2f），觀察到在 768 納米處有一個明顯的吸收峰，可以很好地與 808 納米激光耦合，用于后續(xù)的癌癥 PTT。本研究選擇了來自 C57BL/6J 小鼠自發(fā)性腫瘤細胞的 B16F10 細胞進行下一步實驗。使用標準的 MTT 試驗進一步檢測了 Ti3C2Tx納米片的生物相容性，結(jié)果表明在與 45 μg/mL 的納米片培養(yǎng)后，B16F10 細胞具有良好的存活率。與純 H2O 相比，經(jīng) 808 納米激光照射的 MXene 培養(yǎng)基溫度明顯升高。用 MXene 培養(yǎng)的 B16F10 細胞的存活率隨著激光功率的增加而逐漸降低。此外，根據(jù)計算，Ti3C2Tx 納米片的光熱轉(zhuǎn)換效率約為 30%，高于金納米棒（21%）和 Cu9S5NCs（25.7%）。因此，在接下來的實驗中，MXene 納米片作為一種理想的光熱劑被用于離子凝膠貼片的摻雜。
圖2 光熱劑 MXene 和離子凝膠的特性
本研究在模具中通過紫外燈聚合制備出摻雜了 MXene 納米片的離子凝膠貼片。如圖 2g 所示，從掃描電鏡圖像中可以觀察到貼片相對平坦的表面和內(nèi)部多孔的層狀結(jié)構(gòu)。掃描電鏡能譜和元素圖譜清楚地顯示了鈦元素在離子凝膠中的均勻分散（圖 2h，i），表明 MXene 在離子凝膠中的成功摻雜。由于添加 Ti3C2Tx 后與聚合物網(wǎng)絡相互作用形成氫鍵，與純離子凝膠制成的補丁相比，摻雜 Ti3C2Tx 后的復合補丁具有很好的延展性。用萬能測試儀測試了貼片的應力-應變曲線（圖 3a）。從圖 3b 和 c 中可以看出，隨著 Ti3C2Tx 摻雜含量的增加，離子凝膠的斷裂伸長率和韌性都有所提高。摻入 0.8 毫克/毫升 Ti3C2Tx 的離子凝膠的斷裂伸長率（5.75 兆帕）約為 745%。隨著振動頻率的增加，eT-patch 的存儲模量（G'）和損耗模量（G"）都得到了提高。隨著頻率的增加，在較高頻率下 G" 的值高于 G'，表現(xiàn)為粘性材料。值得注意的是，摻雜 MXene 后，貼片的光熱轉(zhuǎn)換性能顯著提高，在 808 納米激光照射下 10 分鐘，貼片的溫度隨著 MXene 濃度的升高而逐漸升高。同時，隨著激光功率和貼片厚度的增加，貼片的溫度也明顯升高。有趣的是，在同一貼片的不同區(qū)域測得的溫度基本相同，這意味著離子凝膠貼片內(nèi)的 MXene 摻雜基本均勻。在隨后的實驗中，使用了摻雜了 0.8 mg/mL MXene 的離子凝膠貼片，在 0.5 W/cm2 的 808 納米激光照射 10 分鐘后，其溫度高達約 62.4 ℃。值得注意的是，即使用 808 納米激光照射貼片，每次 10 分鐘，循環(huán)五次，該貼片也能顯示出卓越的熱穩(wěn)定性（圖 3d）。此外，本研究還通過熱成像監(jiān)測了不同組（凝膠中摻雜 MXene（GM）和純凝膠（G），分別與電刺激（E）、激光照射（L）以及 ES 和激光同時處理（EL））的溫度變化，并繪制成曲線（圖 3e，f）。結(jié)果表明，純離子凝膠貼片在經(jīng)過激光和 ES 處理后溫度變化不大，ES 對摻雜了 MXene 的離子凝膠貼片的溫度轉(zhuǎn)換影響較小，而摻雜了 MXene 的離子凝膠貼片的溫度則隨著照射時間的延長而明顯升高。
圖3 eT-patch 性能測量
【PES 處理過程中細胞死亡的機制】
在將 eT 貼片應用于皮膚腫瘤治療之前，本研究系統(tǒng)地關(guān)注并揭示了光電刺激對 B16F10 細胞的影響和細胞死亡機制。首先用不同的電流處理在 ITO 玻璃上培養(yǎng)的 B16F10 細胞 10 分鐘，然后用活/死熒光染色法和 MTT 法檢測細胞存活率，結(jié)果表明，隨著刺激電流的增大，細胞存活率逐漸降低，說明電流的增大提高了對癌細胞的殺傷率。于是，本研究選擇了 5 μA 的電流值進行后續(xù)實驗。隨后，用不同的方法處理了 B16F10 細胞（圖 4a、b），結(jié)果表明：PES 處理對細胞的殺傷效果明顯強于其他處理方法。顯然，PES 實驗組的激光照射（同時應用電刺激和光熱刺激）不僅具有增強電流效應，還具有光熱效應，這兩種效應都有利于殺死癌細胞。此外，本研究還選擇了小鼠成纖維細胞 L929 作為正常細胞，以檢驗該方法對正常細胞的損傷是否較小。與 B16F10 細胞相比，受測的 L929 細胞有更高的細胞存活率。因此，腫瘤細胞更有可能在處理過程中受損。顯然，本研究注意到 ES 誘導的死亡細胞顯示出明顯的細胞腫脹，這是典型的熱凋亡特征，而 PTT 引發(fā)的細胞死亡是細胞凋亡，因為細胞形態(tài)明顯起皺。因此，在 PES 治療過程中，細胞熱解和凋亡都能被觸發(fā)，這兩種現(xiàn)象都有利于癌癥治療。為了驗證 PES 能誘導癌細胞熱解和凋亡，本研究使用 RT-PCR（反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應）對 PES 處理前后的相關(guān)基因表達進行了檢測。如圖 4c 所示，與對照組相比，PES 處理后 B16F10 細胞內(nèi)的熱解標志物（GSDME、Caspase-3、IL-1β）和凋亡標志物（Bax、c-Jun、Cyt-c）的基因表達明顯升高。為了進一步證實 ES 引發(fā)了細胞凋亡，使用商用 LDH 檢測試劑盒檢測了乳酸脫氫酶（LDH）作為經(jīng)典的細胞凋亡生物標志物在不同處理后的釋放水平。如圖 4d 所示，PES 和 ES 組 B16F10 細胞的 LDH 釋放水平明顯高于其他組。同時，PES 處理后 B16F10 細胞內(nèi)的 ATP 水平也低于其他處理（圖 4e）。這些結(jié)果表明，PES 策略誘導了細胞的強熱休克。此外，如圖 4f 所示，從生物透射電子顯微鏡（Bio-TEM）圖像中觀察到明顯的線粒體破壞，并伴有明顯的空化和腫脹，這表明 PES 導致了線粒體功能障礙。此外，還使用 2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）檢測了 B16F10 細胞內(nèi)的 ROS 水平，DCFH-DA 可水解生成 DCFH 防滲膜，在內(nèi)部擴散并被非特異性氧自由基氧化生成綠色熒光 DCF。
圖4 PES誘導細胞死亡的機理研究
【eT-patch 治療黑色素瘤的療效評估】
為了評估 eT 貼片在 PES 下對皮膚腫瘤的治療效果，通過皮下移植腫瘤細胞建立了 B16F10 腫瘤 C57BL/6J 小鼠模型，治療方案如圖 5a 所示。首先將體積約為 100 mm3 的腫瘤小鼠隨機分為五組，包括對照組、激光組、PTT 組、ES 組和 PES 組。隨后，小鼠連續(xù)兩天接受不同方法的治療，每次治療 10 分鐘，然后觀察 13 天。15 天后估計不同方法的治療效果。為了揭示電流的流向，檢測并計算了 eT 貼片覆蓋腫瘤前后流過腫瘤的電流值。經(jīng)計算，在 5 V 電壓下，通過獨立貼片的電流值（記為I0）約為 9.3 × 10-5 A。值得注意的是，貼片附著到腫瘤上后，在 5 V 下記錄到的電流值（I1）增加到 ~1.7 × 10-4 A，這表明腫瘤和 eT 貼片之間存在并聯(lián)電阻關(guān)系。電流可以通過貼片流經(jīng)腫瘤表層。為了更好地理解，本研究分別繪制了兩種情況的電路圖，并相應標注了治療過程中的電流流向。為了估算治療的有效深度，對小鼠經(jīng) PES 治療后的腫瘤組織進行了 H&E 和 TUNEL 染色。該方法消融腫瘤的有效深度可達約 5 毫米。特別是，PTT 組和 PES 組腫瘤小鼠的實時紅外熱圖像顯示，在治療過程中局部溫度迅速升高，這意味著 PTT 和 PES 治療非常適合消除腫瘤（圖 5b）。腫瘤熱成像和腫瘤及周圍溫度曲線顯示，腫瘤周圍溫度約為 40 ℃，腫瘤治療過程中對周圍正常組織的損傷較小。通過光學照片記錄了不同處理后小鼠的腫瘤大小（圖 5c），證明 PES 處理對腫瘤的抑制效果顯著。對不同處理后的腫瘤組織進行解剖和稱重，如圖 5d、e 所示，eT 貼片的抗腫瘤效果更優(yōu)。根據(jù)相對腫瘤體積計算出的平均抑制率分別為 ~17.80、17.70、14.13、14.98 和 1.96，如圖 5f 所示。
圖5 黑色素瘤模型的體內(nèi)治療
2. 總結(jié)與展望
綜上所述，本研究研制出了一種由摻雜了MXene的離子凝膠組成的可穿戴雙響應eT貼片，并將其應用于光熱和電刺激（PES）聯(lián)合療法對黑色素瘤的高效治療。eT-patch 具有良好的透明性，可以實時目測皮膚反應，評估皮膚腫瘤的治療效果。本研究初步揭示了 PES 治療的潛在細胞機制，即凋亡和熱凋亡均被觸發(fā)，并與 ROS 誘導的 MMP 減少和 DNA 損傷相關(guān)聯(lián)。令人印象深刻的是，利用易于制造的 eT 貼片進行皮膚癌 PES 治療具有生物安全性高、穩(wěn)定性好、副作用少和調(diào)控靈活等特點。這項研究為探索有效治療黑色素瘤、避免手術(shù)風險的貼片材料提供了新的機遇，并將拓寬離子凝膠的生物醫(yī)學應用。
文章來源：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-45070-z
來源：EngineeringForLife
