剛剛，中檢院發布《皮膚致敏性整合測試與評估策略應用技術指南（征求意見稿）》，內容如下：
（征求意見稿）
一、概述
皮膚變態反應（過敏性接觸性皮炎Allergic contact dermatitis，ACD），是皮膚對一種物質產生的免疫源性皮膚反應。皮膚變態反應試驗是評價化妝品原料致敏性的常用方法，隨著動物福利及科學技術的發展，國際上也逐步開展采用體外試驗、非測試的毒性預測方法等多種毒理學評價工具組合的皮膚致敏性整合測試與評估策略，用于評價化妝品原料的潛在致敏風險。
目前科學上普遍認可皮膚過敏是以蛋白質共價結合為起始事件，經過細胞、組織器官等一系列生物學應答，最終導致過敏性接觸性皮炎這一有害結局。皮膚致敏性整合測試與評估策略基于皮膚致敏有害結局路徑（Adverse Outcome Pathway，AOP）以及針對其中各關鍵事件（Key Events，KEs）研發的系列替代毒理學試驗，整合待評估原料相關數據進行證據權重分析，對化妝品原料潛在的皮膚致敏性風險進行評價。
圖1 皮膚致敏AOP示意圖
在皮膚致敏性AOP中，關鍵事件KE1為分子起始事件，關鍵事件KE2和KE3分別為角質形成細胞應答和樹突狀細胞應答，關鍵事件KE4為組織器官反應（淋巴T細胞增殖）。
二、適用范圍
本應用指南適用于化妝品原料皮膚致敏性評價。采用皮膚致敏性AOP檢測關鍵事件KE1—KE3的毒理學試驗方法組成“3選2試驗”策略，其適用范圍應符合所選所有試驗方法適用性的要求。
三、基本原則
結合化妝品原料的特點，基于皮膚致敏AOP的機制，形成固定的逐步獲取和評估檢測數據的順序測試策略，根據所獲得的檢測結果決定是否需要開展后續檢測，可對化妝品原料皮膚致敏性進行危害識別。在策略中應說明覆蓋了AOP中哪些關鍵事件、試驗方法的選擇順序、對已知不確定性的考慮（如所選試驗方法局限性、陽性結果判定的閾值邊界范圍等）內容。
四、可用的替代方法
目前，《化妝品安全技術規范》中用于檢測皮膚致敏性的替代方法包括：皮膚變態反應：局部淋巴結試驗（LLNA:DA和LLNA: BrdU-ELISA），體外皮膚變態反應試驗：直接多肽反應試驗（DPRA）、氨基酸衍生化反應試驗方法（ADRA）、人細胞系活化試驗（h-CLAT）、U937細胞激活試驗方法（U-SENS）和角質細胞熒光素報告基因測試LuSens方法（LuSens）。
表1 《化妝品安全技術規范》收錄的皮膚致敏性替代試驗匯總表
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關鍵事件
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《化妝品安全技術規范》收錄的方法
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結果判定要求
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KE1
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化妝品用化學原料體外皮膚變態反應：直接多肽反應試驗（DPRA）
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詳見附錄1
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體外皮膚變態反應氨基酸衍生化反應試驗方法（ADRA）
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需說明閾值邊界范圍
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KE2
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體外皮膚變態反應角質細胞熒光素報告基因測試LuSens方法（LuSens）
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詳見附錄2
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KE3
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體外皮膚變態反應人細胞系活化試驗（h-CLAT）
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詳見附錄3
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體外皮膚變態反應U937細胞激活試驗（U-SENS）
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需說明閾值邊界范圍
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KE4
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皮膚變態反應：局部淋巴結試驗：DA（LLNA:DA）
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可得出受試物致敏能力和強度
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皮膚變態反應：局部淋巴結試驗：BrdU-ELISA（LLNA:BrdU-ELISA）
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其中局部淋巴結試驗（LLNA:DA和LLNA: BrdU-ELISA）用于檢測KE4，試驗結果能得出受試物的致敏能力和強度，這些結果可在有限的范圍內外推到人類。
DPRA和ADRA試驗用于檢測KE1；LuSens試驗用于檢測KE2；h-CLAT和U-SENS試驗用于檢測KE3。“3選2試驗”策略應從KE1—KE3中任意選擇兩個關鍵事件，分別選擇相應的替代方法對兩個關鍵事件進行檢測，如兩項試驗結論一致且試驗結果均不在閾值邊界范圍內，則根據一致的結論判定化妝品原料是否具有皮膚致敏性；否則選擇第三項關鍵事件相應的替代方法開展檢測，根據三項試驗中兩項一致的試驗結論判定化妝品原料是否具有皮膚致敏性；若三項試驗結論存在矛盾（一項為陽性結果、一項為陰性結果、一項結果在閾值邊界范圍內）或其中兩項以上試驗結果均在閾值邊界范圍內，則判定無法確定皮膚致敏性風險。
五、注意事項
“3選2試驗”策略的可靠性受組成策略的試驗方法的適用性和局限性、原料理化性質等多種因素綜合影響，預測結果存在一定的不確定性，需在評估過程中予以說明。例如，采用h-CLAT方法時，要求受試物具有可溶性，對正辛醇-水分配系數（LogKow）>3.5的原料，易出現假陽性的結果，可采用其他檢測該關鍵事件的試驗方法組成策略或選擇其他皮膚致敏性評價方法。
雖然每一項試驗方法具有明確的陽性結果判定閾值，但接近閾值的檢測結果在組成策略時，會降低結論的可信度，通過統計試驗方法驗證數據可獲得陽性判定的閾值邊界范圍（borderline range，BL），檢測結果在閾值邊界范圍內的可采用其他檢測該關鍵事件的試驗方法組成策略或選擇其他皮膚致敏性評價方法。
本指南及附錄僅以《化妝品安全技術規范》收錄的試驗方法作為“3選2試驗”策略示例，還可參考國際權威替代方法驗證機構及經濟合作及發展組織（OECD）已驗證的方法，如OECD化學品測試指南、整合測試與評估策略指導文件等，需說明數據解釋程序及不確定分析（如閾值邊界范圍等）。
附錄1
直接多肽反應試驗（DPRA）
本方法適用于單一組分(定量組成的物質，且其中一種主要成分含量至少80%（W/W）)化妝品用化學原料或已知組成成分的多組分原料(定量組成的物質，且其中一種以上成分含量大于等于10%，小于80%)。
按照DPRA的要求開展檢測。根據試驗結果判定標準，當采用1：10半胱氨酸多肽和1：50賴氨酸多肽模型判定時，陽性結果判定值為6.38%，閾值邊界范圍為4.95%—8.32%；當采用1：10半胱氨酸多肽模型判定時，陽性結果判定值為13.89%，閾值邊界范圍為10.56%—18.47%。結果判定策略如表2。
表2 DPRA結果判定策略表
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1：10半胱氨酸多肽和1：50賴氨酸多肽模型結果判定
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0%≤消耗百分比的均值＜4.95%
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是
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消耗百分比的均值在3%-10%之間
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是
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陰性
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否
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按DPRA要求復測
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消耗百分比的均值>8.32%
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是
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消耗百分比的均值>10%
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是
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陽性
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否
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按DPRA要求復測
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4.95%≤消耗百分比的均值≤8.32%
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是
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進行第二次試驗，并按照DPRA要求判定結果：
-如兩次結果為陽性，則判定為陽性；
-如兩次結果為陰性，則判定為陰性；
-如兩次結果均在4.95%-8.32%之間，則判定在閾值邊界范圍內。
如兩次試驗結果不一致，可進行第三次試驗，并根據兩次一致的結果進行判定；如兩次結果均在閾值邊界范圍內或一次結果在閾值邊界范圍內、一次陽性結果、一次陰性結果，則最終判定為在閾值邊界范圍內。
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1：10半胱氨酸多肽模型結果判定
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0%≤消耗百分比＜10.56%
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是
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消耗百分比在9%-17%之間
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是
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陰性
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否
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按DPRA要求復測
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消耗百分比>18.47%
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是
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消耗百分比>17%
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是
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陽性
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否
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按DPRA要求復測
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10.56%≤消耗百分比≤18.47%
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是
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進行第二次試驗，并按照DPRA要求判定結果：
-如兩次結果為陽性，則判定為陽性；
-如兩次結果為陰性，則判定為陰性；
-如兩次結果均在10.56%-18.47%之間，則判定在閾值邊界范圍內。
如兩次試驗結果不一致，可進行第三次試驗，并根據兩次一致的結果進行判定；如兩次結果均在閾值邊界范圍內或一次結果在閾值邊界范圍內、一次陽性結果、一次陰性結果，則最終判定為在閾值邊界范圍內。
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附錄2
角質細胞熒光素報告基因測試LuSens法
本方法適用于可用LuSens細胞培養液或DMSO配制試驗溶液的化妝品用化學原料。
按照LuSens的要求開展檢測。根據試驗結果判定標準，陽性結果判定值為1.5倍，閾值邊界范圍為1.28—1.76倍。結果判定策略如表3。
表3 LuSens結果判定策略表
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與溶劑對照組相比，誘導倍數≥1.76，有統計學差異；且至少兩個連續測試濃度細胞存活率≥70%
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是
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至少三個測試濃度無細胞毒性
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是
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陽性
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否
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按LuSens要求復測
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否
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與溶劑對照組相比，誘導倍數＜1.28，且至少一個測試濃度細胞存活率＜70%（或最大無細胞毒性測試濃度達到2000μM）
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是
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陰性
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否
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與溶劑對照組相比，1.28≤誘導倍數＜1.76，有統計學差異；且至少兩個連續測試濃度細胞存活率≥70%
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是
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至少三個測試濃度無細胞毒性
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在閾值邊界范圍內
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否
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按LuSens要求復測
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按LuSens要求至少進行兩次平行試驗：
-如兩次結果為陽性，則判定為陽性；
-如兩次結果為陰性，則判定為陰性；
-如兩次結果均為1.28-1.76之間，則判定在閾值邊界范圍內。
如兩次試驗結果不一致，可進行第三次試驗，并根據兩次一致的結果進行判定；如兩次結果均在閾值邊界范圍內或存在一次在閾值邊界范圍內、一次陽性結果、一次陰性結果，則最終判定在閾值邊界范圍內。
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附錄3
人細胞系活化試驗（h-CLAT）
本方法適用于可用THP-1細胞培養液、生理鹽水或DMSO配制試驗溶液的化妝品用化學原料，對正辛醇-水分配系數（LogKow）> 3.5的化學品，易出現假陰性的結果，需采用其他試驗進一步確證受試物的致敏性。由于缺乏機體代謝過程，本方法不適用于對前抗原（即需要通過酶活化的物質）和半抗原（即需要通過氧化活化的物質）物質的致敏性檢測。
按照h-CLAT的要求開展檢測。根據試驗結果判定標準，陽性結果判定值CD86誘導值為150%，閾值邊界范圍為122%—184%，CD54誘導值為200%，閾值邊界范圍為157%—255%。結果判定策略如表4。
表4 h-CLAT結果判定策略表
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CD54誘導值≤157%
和
CD86誘導值≤122%
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是
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陰性
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CD54誘導值≤255%
和
CD86誘導值≤184%
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是
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細胞活性≥50%
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否
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陰性
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是
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在閾值邊界范圍內
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CD54誘導值>255%
和/或
CD86誘導值>184%
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是
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細胞活性≥50%
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否
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陰性
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是
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陽性
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按h-CLAT要求至少進行兩次平行試驗：
-如兩次結果為陽性，則判定為陽性；
-如兩次結果為陰性，則判定為陰性；
-如兩次結果均在閾值邊界范圍內，則判定為在閾值邊界范圍內。
如兩次試驗結果不一致，可進行第三次試驗，并根據兩次一致的結果進行判定；如兩次結果均在閾值邊界范圍內或存在一次結果在閾值邊界范圍內、一次陽性結果、一次陰性結果，則最終判定為在閾值邊界范圍內。
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附錄4
化妝品原料“3選2試驗”策略應用示例
注：實例所用數據非真實數據，僅為展示策略步驟
1.待評估物質信息
無色透明液體，LogKow＜3.5，同時符合開展DPRA、LuSens和h-CLAT試驗的要求。其他信息略。
2.“3選2”試驗策略示例
步驟一：開展DPRA試驗，采用1：10半胱氨酸多肽和1：50賴氨酸多肽模型判定結果，檢測半胱氨酸和賴氨酸消耗百分比的均值為30%，結果判定為陽性（消耗百分比的均值>8.32%且>10%），中度反應。
步驟二：開展LuSens試驗，檢測結果與溶劑對照組相比，誘導倍數小于1，且最大測試濃度細胞活存活率為65%，其余測試濃度細胞存活率均大于70%，結果判定為陰性（與溶劑對照組相比，誘導倍數＜1.28，且至少一個測試濃度細胞存活率＜70%）。
步驟三：由于上述2個試驗結論不一致，開展h-CLAT試驗進行確證，檢測結果CD86誘導值為200%，CD54誘導值為300%，所有測試濃度細胞存活率均大于80%，結果判定為陽性（CD54誘導值>255%和CD86誘導值>184%，細胞活性≥50%）。
步驟四：綜合3選2試驗結果，DPRA和h-CLAT結論一致，判定該物質致敏性為陽性。
《皮膚致敏性整合測試與評估策略應用技術指南（征求意見稿）》起草說明
為配合開展化妝品安全評估工作，提升和促進安全評估相關技術的應用能力，依據《化妝品安全技術規范（2015年版）》（以下簡稱《技術規范》）等相關法律法規和規范性文件要求，國家藥監局化妝品監管司組織中國食品藥品檢定研究院（以下稱中檢院）起草了《皮膚致敏性整合測試與評估策略應用技術指南（征求意見稿）》（以下稱《指南（征求意見稿）》）?，F將起草的有關情況說明如下：
一、起草原則
《指南（征求意見稿）》要求和規定逐步與國際接軌，對于已經比較成熟的、被國際權威組織認可并應用的方法，原則上予以接受。對某些內容結合我國標準制修訂和行業實際應用情況進行具體化和明確化，在盡量提高操作性的同時，兼顧了技術發展的前瞻性。《指南（征求意見稿）》制定過程中還遵循了科學性和合理性、協調性和有效性，通俗性和規范性之間的關系。
二、與我國已有相關標準的關系
《技術規范》中用于檢測皮膚變態反應的方法包括：皮膚變態反應試驗、皮膚變態反應：局部淋巴結試驗:DA（LLNA:DA）、皮膚變態反應：局部淋巴結試驗:BrdU-ELISA(LLNA: BrdU-ELISA)、化妝品用化學原料體外皮膚變態反應：直接多肽反應試驗(DPRA)、體外皮膚變態反應 氨基酸衍生化反應試驗方法（ADRA）、體外皮膚變態反應 人細胞系活化試驗（h-CLAT）、體外皮膚變態反應 U937細胞激活試驗方法（USENS）。其中皮膚變態反應試驗、LLNA:DA、LLNA: BrdU-ELISA均使用動物（豚鼠、小鼠）進行試驗，試驗結果能得出受試物的致敏能力和強度，這些結果可在有限的范圍內外推到人類。DPRA和ADRA方法針對皮膚致敏性有害結局路徑（AOP）中的第一個關鍵事件進行檢測,h-CLAT和USENS方法針對第三個關鍵事件進行檢測。
《指南（征求意見稿）》基于皮膚致敏性AOP的機制過程，將《技術規范》中現有替代方法進行有序整合，形成“3選2試驗”策略，以彌補單一檢測方法的局限性，進一步提高替代試驗方法的可靠性和應用水平，為化妝品原料安全評估提供替代試驗的毒理學數據。
三、與國際同類標準的關系
2016年，OECD發布了“關于皮膚致敏整合測試與評估方法(IATA)中使用的定義的方法報告和各信息源的指導文件”（Guidance document on the reporting of defined approaches and individual information sources to be used within Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA) for skin sensitization），該指導文件中提供了形成IATA的原則和框架、確定的方法（Defined Approach，DA）概述和整合策略示例等。2021年，OECD又發布了“皮膚致敏性確定的方法指南”（Guideline No.497 Guideline on Defined Approaches for Skin Sensitisation），該指南文件明確了“3選2試驗”等策略，可用于化學物質皮膚致敏性危害識別。
《指南（征求意見稿）》基本覆蓋OECD No.497中“3選2”試驗策略的內容和原則，結合《技術規范》制修訂計劃，僅將OECD指南中將KE2檢測方法由KeratinoSens替換為LuSens，LuSens與KeratinoSens同為OECD TG442D中認可的KE2檢測方法，形成策略時LuSens的閾值邊界范圍參考歐盟動物替代方法驗證機構ECVAM 2022年更新發布的LuSens方法操作標準（DB-ALM Protocol No.184 Annex 5）。
四、需要說明的問題
（一）關于可用的方法。本《指南（征求意見稿）》在參考國際相關技術指南的基礎上，結合《技術規范》標準制修訂情況，充分考慮行業需求、方法認可情況和可操作、可推廣等多方面因素研究制定。
（二）關于動態更新。隨著替代方法等技術逐步發展，國內外標準等不斷情況，將繼續研究相關評估工具，進一步完善和豐富整合策略。
