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嘉峪檢測網 2024-12-08 11:09
前置知識
ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶聯免疫吸附試驗）是一種常用的實驗技術，用于檢測和定量分析樣品中特定抗原或抗體的存在。ELISA是基于免疫學原理的一種高靈敏度和高特異性的實驗方法。
ELISA實驗通常包括以下步驟：
1. 涂覆：將待檢測的抗原或抗體溶液加入到微孔板（通常是96孔板）中，并在孔板表面上形成一層固定的抗原或抗體。這個過程被稱為涂覆。
2. 阻斷：為了防止非特異性結合，需要在涂覆后加入一種阻斷劑，例如牛血清蛋白（BSA）或牛奶粉，以覆蓋孔板上未被固定的表面。阻斷劑可以減少非特異性結合和降低背景信號。
3. 樣品加入：將待測樣品加入到微孔板中，樣品中的目標抗原或抗體與固定在孔板上的抗體或抗原相互作用。
4. 洗滌：通過反復洗滌孔板，去除未結合的物質，以減少背景信號。
5. 探針加入：加入與待測物體特異性結合的酶標記二抗（例如辣根過氧化物酶-HRP）或酶標記抗原，使其與樣品中的目標物體結合。
6. 洗滌：再次洗滌孔板，去除未結合的酶標記物。
7. 底物加入：加入一種底物，其與酶標記物相互作用，產生可測量的信號。常用的底物是一種可被酶催化產生顏色或熒光的物質。
8. 反應停止：通過加入一種停止劑，停止底物的反應，阻止信號進一步增加。
9. 信號測量：使用光譜儀或熒光測量儀測量底物反應產生的信號，根據信號的強度來確定樣品中目標物體的濃度。
ELISA是分子生物學、免疫學和細胞生物學研究中常用到的實驗操作之一，相信大家常常會有這樣那樣的實驗問題。
問題：ELISA空白背景高的常見原因和處理方法
通常陰性孔吸光光度值不會超過0.1。
常見原因有以下這些：
1）洗板不干凈
解決方法：
①充分洗滌：如果洗板的時間不夠，會導致抗體殘留，陰性對照會顯色，嘗試延長洗板時間，增加洗板頻率，在洗液中添加表面活性劑Tween-20。
在洗板時要保證每步都洗滌完全，充分拍板直至孔內沒有明顯的殘留液體。
②避免交叉污染：棄去洗液和孵育的抗體時避免交叉污染，移液槍頭盡可能一次性使用，拍板的濾紙不要反復使用。
2）顯色液變質或者試劑過期
解決方法：檢查試劑盒有效期，或使用新的試劑盒并按照說明書要求保存試劑盒。每次用剩下的顯色液最好不要回收，或者只回收洗凈的容器裝的顯色液。
3）試劑稀釋有誤，檢測抗體/酶結合物工作液濃度過高
解決方法：按照說明書推薦的稀釋倍數稀釋抗體。
4）試劑盒組分未平衡
解決方法：試劑盒每個組分都需要平衡至室溫后進行實驗。
5）混用其他試劑盒試劑
解決方法：保證使用試劑盒內完整的一套試劑進行實驗，不同品牌及不同批次間的試劑可能存在不匹配現象，不同批號的試劑不要混用。
6）蒸餾水受酶等污染
解決方法：使用新鮮蒸餾水。
7）培養箱溫度超過37℃或反應時間過長
解決方法：孵育時間過長、溫度過高可能會導致非特異性結合增加，從而造成本底增高。檢查恒溫箱，確保孵育溫度穩定在37℃，按照說明書的反應時間進行孵育。
8）酶標板底部有污漬
解決方法：在加完終止液之后，檢測之前，用75%乙醇浸潤的脫脂棉球擦拭酶標板底部，確認沒有污漬之后再檢測。
9）洗液被污染
解決方法：洗液現配現用，長期放置會析出，也可能會污染，導致背景偏高。
10）包被的抗原被污染
解決辦法：仔細回想操作過程，換新的抗原包被。
11）封閉液、封閉時間、封閉液的濃度
解決辦法：封閉液（BSA）可能會與抗體產生交叉反應。封閉液的濃度偏低、封閉時間過短導致封閉不徹底，抗體與酶標板結合，可能也會導致背景偏高，因此可以適當調整封閉液的濃度和時間以降低背景。
12）抗體質量差或選擇的抗體不合適
解決辦法：抗體質量不高，特異性不好可能會與封閉液（BSA）產生交叉反應，可以用0.8%明膠（明膠不含有血清成分）代替。
若選擇多克隆抗體孵育，可能會與酶標單抗產生交叉反應，導致背景增加，最好選用與酶標單抗同種屬的多克隆抗體。
13）酶標儀設置參數有誤
解決辦法：檢查酶標儀設置的波長，不同波長下樣品的吸光光度值也會有很大的差別，按照說明書要求設置參數。
參考資料：
https://www.wellplate.com/immunoassay-surfaces/
https://www.news-medical.net/life-sciences/Enzyme-linked-Immunosorbent-Assay-%28ELISA%29-Methodology.aspx
來源：實驗老司機
