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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2024-12-25 08:28
摘 要： 基于高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（HPLC-DAD）獲得的色譜-光譜數(shù)據(jù)，建立了一種二元完全重疊液相色譜峰的快速解析定量方法：將HPLC-DAD采集的時(shí)間t、波長(zhǎng)λ、吸光度S的三維光譜色譜數(shù)據(jù)，光譜經(jīng)過(guò)背景補(bǔ)償加Savitzky-Golay平滑預(yù)處理，得到光譜波長(zhǎng)方向的吸光度強(qiáng)度處理值隨時(shí)間變化的光譜圖，與對(duì)照品光譜計(jì)算光譜相似度，實(shí)現(xiàn)重疊峰的快速智能化識(shí)別；利用導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖法對(duì)預(yù)處理的色譜-光譜矩陣進(jìn)行解析，獲得原點(diǎn)波長(zhǎng)，再利用二維相關(guān)光譜技術(shù)提取特征光譜后，得到基于特征光譜的原點(diǎn)波長(zhǎng)的色譜流出曲線，進(jìn)而得到分離后的色譜峰，實(shí)現(xiàn)重疊色譜峰的定量測(cè)定。該方法充分利用HPLC-DAD獲得的三維色譜-光譜數(shù)據(jù)信息，能夠?qū)⒍耆丿B色譜峰有效解析分離和定量測(cè)定，明顯提高解析結(jié)果的準(zhǔn)確度，并利用色譜工作站實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)采集、解析識(shí)別、定量分析一體化智能分析，方法簡(jiǎn)單高效。
關(guān)鍵詞： 二維相關(guān)譜技術(shù)； 導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖法； 高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器； 化妝品； 重疊峰； 識(shí)別； 解混
高效液相色譜法-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)聯(lián)用技術(shù)作為復(fù)雜組分分離和定量分析的手段之一，具有分析速度快、分離效率高、樣品用量少等優(yōu)勢(shì)[1]，通過(guò)成功的色譜分離，實(shí)現(xiàn)混合物中各物質(zhì)的定性和定量分析[2]。多數(shù)色譜工作站采集的是時(shí)間、波長(zhǎng)、吸光度強(qiáng)度三維數(shù)據(jù)而獲得三維色譜-光譜圖，但是隨著樣本復(fù)雜程度的提高，往往會(huì)有重疊峰的出現(xiàn)，事實(shí)上，實(shí)際色譜圖中絕大多數(shù)色譜峰都為重疊峰，重疊峰的紫外吸收光譜不利于對(duì)結(jié)構(gòu)確證和色譜峰的識(shí)別，而色譜峰用于定量計(jì)算主要是獲得每個(gè)單峰的面積，因此重疊峰的分離是方法開(kāi)發(fā)的一個(gè)難題[3]。重疊峰的分離多采用優(yōu)化色譜條件的方法，但方法優(yōu)化費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)于多組分復(fù)雜基質(zhì)的分離效果也不盡如人意；隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)的發(fā)展，將三維色譜光譜信息，按一定的數(shù)學(xué)模型處理，能解決重疊峰的識(shí)別和定量難題，目前常用的重疊峰解析方法包括模式識(shí)別[4]、曲線擬合[2,5-6]、小波轉(zhuǎn)化法[7?8]、因子分析[9]、正交投影[10]等方法，然而上述方法多為光譜解析方法，即在一維水平上進(jìn)行解析，存在解析結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性不高的問(wèn)題，解析結(jié)果易受色譜峰重疊度的影響；且利用色譜工作站數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)的化學(xué)計(jì)量學(xué)解析分離算法報(bào)道較少。
二維相關(guān)譜技術(shù)(2D-COS)[11]是將傳統(tǒng)光譜信號(hào)擴(kuò)展到三維平面上，光譜圖具有兩個(gè)獨(dú)立的變量和一個(gè)表示體系光譜學(xué)性質(zhì)的因變量，從而形成三維立體數(shù)據(jù)，通過(guò)研究體系光譜學(xué)性質(zhì)隨兩個(gè)變量(特定外擾)變化的情況以及兩個(gè)變量的相關(guān)性，可提供研究體系中不同組分官能團(tuán)吸收峰之間的相關(guān)信息，可有效地對(duì)弱峰、覆蓋峰、偏移峰進(jìn)行解析，具有較高的光譜分辨率；而且可以通過(guò)同步和異步譜交叉峰正負(fù)或有無(wú)明確各分子官能團(tuán)振動(dòng)變化先后順序，可以分析信息來(lái)源，提高光譜的解釋能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物結(jié)構(gòu)的解析；二維相關(guān)譜技術(shù)表征的是隨特定外擾變化的信息，消除了強(qiáng)背景信號(hào)對(duì)待測(cè)組分弱信號(hào)的干擾，有助于提取復(fù)雜體系中隨外擾變化微弱的特征信息。加上外擾選擇方式的多樣性，如溫度、時(shí)間、濃度、激發(fā)波長(zhǎng)、偏振角、pH等；探針的多樣性，包括紅外光譜、拉曼光譜、熒光光譜、NMR、X射線等，因此，相對(duì)于傳統(tǒng)一維光譜，二維相關(guān)譜技術(shù)具有高選擇性、高分辨率、高圖譜解析能力，是一種強(qiáng)大靈活的光譜技術(shù)。正是由于二維相關(guān)譜的上述優(yōu)勢(shì)，自廣義二維相關(guān)譜理論提出以后，該技術(shù)就被廣泛應(yīng)用于物理、化學(xué)[12]、材料[13]、食品[14]、環(huán)境[15]等領(lǐng)域。
導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖法(i-PDeA)是對(duì)由二極管陣列檢測(cè)器(DAD)得到的數(shù)據(jù)，將光譜波長(zhǎng)方向的導(dǎo)數(shù)值隨時(shí)間變化轉(zhuǎn)化為色譜圖的方法。它的基本原理是通過(guò)對(duì)色譜-光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)導(dǎo)數(shù)運(yùn)算，從而增強(qiáng)和突出樣品中的特定信息，由于導(dǎo)數(shù)光譜值遵從朗伯-比耳定律，且具有加和性，以便更容易識(shí)別和定量分析化合物。i-PDeA具有峰增強(qiáng)、噪聲減小、無(wú)需基線校正、提供結(jié)構(gòu)特征等優(yōu)勢(shì)，特別適用于復(fù)雜或重疊的光譜解析。它在化學(xué)、生物化學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域中都有廣泛的應(yīng)用[16]。
依據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)7.2節(jié)對(duì)苯二胺等32種組分的檢測(cè)方法，使用HPLC-DAD同時(shí)分析染發(fā)劑中的32種染料成分時(shí)，共有3個(gè)色譜系統(tǒng)，第1個(gè)色譜系統(tǒng)分離包括對(duì)氨基苯酚等16個(gè)組分，第2個(gè)色譜系統(tǒng)分離包括2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽等10個(gè)組分，第3個(gè)色譜系統(tǒng)分離其余8個(gè)組分。當(dāng)待測(cè)樣品中同時(shí)含有對(duì)氨基苯酚和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽時(shí)，在第2個(gè)色譜系統(tǒng)下，對(duì)氨基苯酚的色譜峰會(huì)對(duì)2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽的色譜峰產(chǎn)生干擾，形成完全重疊峰，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽的含量，如果通過(guò)調(diào)節(jié)色譜條件實(shí)現(xiàn)干擾色譜峰的完全分離，分離過(guò)程不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且會(huì)影響組內(nèi)其他10個(gè)色譜峰的分離，達(dá)不到預(yù)期效果。
筆者以化妝品中染發(fā)劑對(duì)苯二胺和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽為例，采用二維相關(guān)譜技術(shù)，以濃度為外擾，構(gòu)建其分析體系的同步和異步二維相關(guān)光譜，根據(jù)同步譜中交叉峰的正負(fù)和異步譜中交叉峰的有無(wú)提取特征光譜波長(zhǎng)，并對(duì)色譜-光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)一階導(dǎo)數(shù)運(yùn)算，分別提取特征原點(diǎn)波長(zhǎng)λx和λy通道的導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖，得到將混合組分分離后的導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖，實(shí)現(xiàn)在色譜分析軟件上自動(dòng)化的色譜解析分離以及兩種完全重疊組分的定性和定量分析，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)采集、預(yù)處理、光譜色譜解析一體化自動(dòng)分析。該研究不僅為化妝品中安全風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)HPLC-DAD色譜-光譜庫(kù)的建立提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，也為復(fù)雜體系中多組分的重疊峰同時(shí)分析提供一種可行性方法，并實(shí)現(xiàn)了利用色譜分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、解析識(shí)別、定量分析一體化智能分析，簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)處理方法，提高了檢測(cè)效率。
1、 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：30A型，包括SPD-30A二極管陣列檢測(cè)器(DAD)和LCsolution色譜工作站，日本島津公司。
超聲波清洗器：Wiggens UA22MFD型，德國(guó)瓦里根公司。
高速離心機(jī)：Thermo ST16型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件：Origin2021軟件、SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件。
甲醇、乙腈：均為色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。
超純水儀：Milli-Q型，美國(guó)密理博公司。
對(duì)氨基苯酚對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.59%，批號(hào)為G979983，德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司。
2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%，批號(hào)為FS1618266，天津阿爾塔公司。
11批次染發(fā)劑樣品：來(lái)自2022年國(guó)家化妝品監(jiān)督抽檢的染發(fā)劑樣品。
實(shí)驗(yàn)用水由超純水儀制備。
1.2 儀器工作條件
色譜柱：SUPELCO Discovery RP-AMIDE C16保護(hù)柱(50 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)色譜科公司)和Discovery RP-AMIDE C16分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)色譜科公司)；流動(dòng)相：A相為磷酸鹽混合溶液[稱取十二水合磷酸氫二鈉1.8 g、磷酸二氫鉀2.8 g和庚烷磺酸鈉(C7H15SO3Na)1.0 g，用水稀釋至1 L，混勻，制成含庚烷磺酸鈉(1 g/L)的磷酸鹽緩沖液，用磷酸溶液(10%)調(diào)節(jié)pH至6.0]，B相為甲醇；洗脫方式：等度洗脫，A相∶B相=90∶10(體積比)；流量：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：190～400 nm；柱溫：25 ℃，進(jìn)樣體積：5 μL。
1.3 實(shí)驗(yàn)步驟
1.3.1 樣品預(yù)處理
稱取樣品0.5 g (精確到0.001 g)于10 mL具塞比色管中，加入50 %乙醇水溶液至10 mL標(biāo)線，渦旋1 min，冰浴超聲提取15 min，在0 ℃下以10 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.45 µm微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為樣品溶液，并盡快測(cè)定。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制
精密稱取對(duì)氨基苯酚和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽對(duì)照品約50 mg，置于10 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至標(biāo)線，配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用無(wú)水乙醇稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為5、10、25、50、100、250、500 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。臨用現(xiàn)配。
1.3.3 數(shù)據(jù)的獲得
在1.2節(jié)儀器工作條件下分別測(cè)定對(duì)氨基苯酚（以下簡(jiǎn)稱成分x）和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽（以下簡(jiǎn)稱成分y）的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液，分別獲得對(duì)氨基苯酚和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽對(duì)照品溶液的三維譜圖數(shù)據(jù)以及二者混合對(duì)照溶液的完全重疊峰的譜圖數(shù)據(jù)，圖1為成分x和成分y混合對(duì)照品溶液、成分x和成分y對(duì)照品的三維色譜-光譜圖。
圖1 三維色譜-光譜圖
Fig. 1 Three-dimensional graphs of the peaks
2、 結(jié)果與討論
2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理
光譜分析中常用預(yù)處理方法一般為背景補(bǔ)償、Savitzky-Golay卷積平滑、一階/二階導(dǎo)數(shù)校正(1stDer/2stDer)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)、最大最小歸一化、光譜數(shù)據(jù)中心化等。背景補(bǔ)償和S-G卷積平滑可以減小儀器噪聲對(duì)光譜的影響，提高信噪比，而不改變光譜形狀和寬度；導(dǎo)數(shù)校正可以消除基線漂移、提高光譜分辨率[16]。
利用LCsolution色譜工作站處理數(shù)據(jù)，選擇成分x和成分y對(duì)照品溶液采集的吸收光譜，或者選擇成分x和成分y混合對(duì)照品溶液采集的重疊色譜峰中僅存在成分x和y的保留時(shí)間處，將色譜峰斜率上升時(shí)的光譜視為成分x的吸收光譜，斜率下降時(shí)的光譜視為y的吸收光譜，對(duì)其吸收光譜進(jìn)行背景補(bǔ)償加Savitzky-Golay平滑預(yù)處理，去除噪音和背景干擾、降低基線漂移的影響，但是不改變光譜形狀和寬度。將預(yù)處理后的標(biāo)準(zhǔn)化光譜與對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)化光譜庫(kù)(自建數(shù)據(jù)庫(kù))比較，進(jìn)行庫(kù)搜索，計(jì)算相似度，進(jìn)行色譜峰識(shí)別。
圖2為成分x和成分y的對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)化光譜圖以及其解析分離后的標(biāo)準(zhǔn)化光譜圖，由解析分離后的標(biāo)準(zhǔn)化光譜圖與對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)化光譜計(jì)算相似度，成分x相似度為0.998 220，成分y的相似度為0.998 267，均大于相似度閾值0.99。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重疊峰經(jīng)過(guò)解析分離后，可以實(shí)現(xiàn)色譜峰的快速智能化識(shí)別。
圖2 光譜圖
Fig. 2 Spectrum of the peaks
2.2 特征波長(zhǎng)的提取
將不同濃度待測(cè)物系列對(duì)照品溶液，按照1.3.1采集其隨濃度變化的二維動(dòng)HPLC-DAD色譜-光譜數(shù)據(jù)。根據(jù)Noda理論[17]及選擇濃度為外擾，并將采集的混合染發(fā)劑體系隨外擾變化的一維動(dòng)態(tài)光譜矩陣A(m×n)，基于式(1)和式(2)進(jìn)行相關(guān)計(jì)算，分別得到混合染發(fā)劑體系隨外擾變化的同步和異步二維相關(guān)譜矩陣Φ（ν1,ν2）和Ψ（ν1,ν2）：
(1)
(2)
式中：m——動(dòng)態(tài)光譜數(shù)；
n——光譜變量數(shù)；
T——表示轉(zhuǎn)置；
N——Hilbert-Noda矩陣。
(3)
式中：Njk——Hilbert-Noda矩陣第j行和第k列的值。
根據(jù)同步譜中交叉峰的正負(fù)和異步譜中交叉峰的有無(wú)提取特征光譜波長(zhǎng)，見(jiàn)圖3。同步圖3(a)中包括自相關(guān)峰和交叉峰，對(duì)角線上的峰為自相關(guān)峰，對(duì)角線外的為交叉峰。對(duì)于對(duì)氨基苯酚同步二維相關(guān)譜，在主對(duì)角線197、230 nm處存在自相關(guān)峰，表明此波長(zhǎng)處的紫外吸收峰強(qiáng)度隨外擾的變化而變化，在主對(duì)角線外側(cè)(197，230)、(197，295) nm處存在正交叉峰，表明3個(gè)紫外吸收峰強(qiáng)度隨外擾變化方向相同，其可能來(lái)自同一組分。對(duì)于2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽同步二維相關(guān)譜[見(jiàn)圖4(a)]，在主對(duì)角線207 nm處存在自相關(guān)峰，表明此波長(zhǎng)處的紫外吸收峰強(qiáng)度隨外擾的變化而變化。在主對(duì)角線外側(cè)(206，299) nm處存在正交叉峰，表明3個(gè)紫外吸收峰強(qiáng)度隨外擾變化方向相同，其可能來(lái)自同一組分，且為其特征吸收峰。同步和異步二維相關(guān)譜計(jì)算結(jié)果表明197、230、295和206、299 nm處紫外吸收峰分別為對(duì)氨基苯酚和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽的特征波長(zhǎng)。
圖3 對(duì)氨基苯酚二維相關(guān)光譜
Fig. 3 Two dimensional correlation spectrum of p-aminophenol
圖4 2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽相關(guān)光譜
Fig. 4 Two dimensional correlation spectrum of 2，4-diaminophenoxyethanolamine hydrochloride
2.3 原點(diǎn)波長(zhǎng)的確定
導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖法(i-PDeA)[16]是將某波長(zhǎng)光譜的導(dǎo)數(shù)值隨時(shí)間變化轉(zhuǎn)化為色譜圖的方法，DAD將通過(guò)檢測(cè)池的透射光經(jīng)全息光柵色散后形成多色光，同時(shí)檢測(cè)多波長(zhǎng)下的吸收可得到采集時(shí)間內(nèi)的色譜-光譜三維圖，如果將時(shí)間t、波長(zhǎng)λ的三維色譜光譜設(shè)為S(t，λ)，則波長(zhǎng)λd的導(dǎo)數(shù)光譜-色譜
表示為：
(4)
圖5(a)是兩種成分(目標(biāo)成分x和y)的吸收光譜，圖5(b)是對(duì)吸收光譜沿波長(zhǎng)方向求導(dǎo)后的導(dǎo)數(shù)光譜。將圖5中成分x的導(dǎo)數(shù)光譜內(nèi)導(dǎo)數(shù)為0的波長(zhǎng)設(shè)為λx，成分y的導(dǎo)數(shù)光譜內(nèi)導(dǎo)數(shù)為0的波長(zhǎng)設(shè)為λy。波長(zhǎng)λx的導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖顯示僅含成分y的洗脫曲線、波長(zhǎng)λy的導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖顯示僅含成分x的洗脫曲線，也就是說(shuō)可利用波長(zhǎng)λx的導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖僅分離y成分，同時(shí)可利用波長(zhǎng)λy的導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖僅分離x成分。因?yàn)?img alt="" src="/uploads/allimg/241225/86-2412250R610F2.jpg" style="width: 53px; height: 27px;" />為負(fù)值，導(dǎo)致導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖的峰值為負(fù)，所以需進(jìn)行正負(fù)反轉(zhuǎn)。
圖5 成分x和y的光譜和導(dǎo)數(shù)光譜
Fig.5 Spectra and derivative spectra of components x and y
將采集時(shí)間內(nèi)的時(shí)間t，波長(zhǎng)λ的三維色譜光譜設(shè)為S(t，λ)三維數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)2.1的光譜預(yù)處理，對(duì)吸收光譜沿波長(zhǎng)方向求導(dǎo)后得到導(dǎo)數(shù)光譜，以成分x導(dǎo)數(shù)光譜值為0的波長(zhǎng)創(chuàng)建原點(diǎn)波長(zhǎng)，所以波長(zhǎng)λx的導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖顯示僅含成分y的洗脫曲線、波長(zhǎng)λy的導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖顯示僅含成分x的洗脫曲線，也就是說(shuō)可利用波長(zhǎng)λx的導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖僅分離y成分，同時(shí)可利用波長(zhǎng)λy的導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖僅分離x成分。因?yàn)樵诓ㄩL(zhǎng)λy處成分x的導(dǎo)數(shù)光譜為負(fù)值，導(dǎo)致導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖的峰值為負(fù)，所以需進(jìn)行正負(fù)反轉(zhuǎn)。可獲得已去除該成分的色譜圖，同法創(chuàng)建成分y的原點(diǎn)波長(zhǎng)，求取各導(dǎo)數(shù)光譜的原點(diǎn)波長(zhǎng)，一階導(dǎo)數(shù)的原點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。當(dāng)存在多個(gè)原點(diǎn)波長(zhǎng)時(shí)，選擇成分x和成分y的特征波長(zhǎng)，且另一成分的強(qiáng)度絕對(duì)值大的波長(zhǎng)，將成分x的導(dǎo)數(shù)光譜值的特征波長(zhǎng)且是原點(diǎn)波長(zhǎng)設(shè)為λx，成分y的導(dǎo)數(shù)光譜值的特征波長(zhǎng)且是原點(diǎn)波長(zhǎng)設(shè)為λy，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成分x的原點(diǎn)波長(zhǎng)為λx=196.59 nm，成分y的原點(diǎn)波長(zhǎng)為λy=206.17 nm。
表1 一階導(dǎo)數(shù)的原點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果
Tab. 1 Results of origin detection of first-order derivatives
2.4 流出曲線的擬合
求取成分x的導(dǎo)數(shù)光譜在波長(zhǎng)λx=196.59 nm的吸收強(qiáng)度值±Py和成分y的導(dǎo)數(shù)光譜在波長(zhǎng)λy=206.17 nm的吸收強(qiáng)度值±Px，分別提取特征原點(diǎn)波長(zhǎng)λx和λy通道的導(dǎo)數(shù)色譜圖，得到將x和y分離后的導(dǎo)數(shù)色譜圖(見(jiàn)圖6)，利用導(dǎo)數(shù)色譜圖，可以得到各成分分離后的色譜圖，系列混合對(duì)照品溶液的色譜數(shù)據(jù)同法處理，利用峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。
a—樣品中成分x和y的重疊色譜峰；b—經(jīng)過(guò)解析分離后成分x的色譜峰；c—經(jīng)過(guò)解析分離后成分y的色譜峰圖6 實(shí)際樣品重疊色譜峰解析
Fig. 6 Analysis of overlapping chromatographic peaks in actual samples
2.5 線性關(guān)系、檢出限與定量限
應(yīng)用該方法對(duì)染發(fā)劑中常見(jiàn)的對(duì)氨基苯酚和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽的重疊峰進(jìn)行解析，然后計(jì)算解析得到的光譜和對(duì)照品的相似度，均大于相似度閾值0.99，說(shuō)明由分離重疊峰得到的光譜與對(duì)照品的光譜無(wú)明顯差異。在1.2色譜條件下，對(duì)對(duì)氨基苯酚和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽的重疊峰進(jìn)行解析分離，分別提取色譜流出曲線，利用色譜峰峰面積(I)和對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度(ρ)進(jìn)行一元線性回歸，計(jì)算得到成分x和成分y的線性方程、相關(guān)系數(shù)，測(cè)定11批樣品成分x和成分y的含量，以提取色譜峰信噪比為3對(duì)應(yīng)的樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為方法檢出限，信噪比為10對(duì)應(yīng)的樣品中質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為方法定量限。成分x和成分y的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，成分x和y的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.997、0.999 9，方法檢出限分別為0.026、0.032 μg/kg，定量限分別為0.08、0.1 μg/kg。
表2 成分x和y的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限
Tab. 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients，detection limits and quantitation limits for components x and y
2.6 對(duì)比試驗(yàn)
通過(guò)優(yōu)化色譜條件分離兩種混合物，利用色譜峰峰面積和對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度進(jìn)行一元線性回歸測(cè)定其含量，比較解析分離和色譜分離兩種方法計(jì)算兩種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量Z=-0.616，對(duì)應(yīng)的概率值P=0.538，顯著性水平α為0.05，由于P=0.538＞0.05，因此接受零假設(shè)，認(rèn)為兩種方法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，即經(jīng)過(guò)解析分離后與色譜分離后的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。從光譜的相似性和含量測(cè)定的比較結(jié)果可知，對(duì)氨基苯酚和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽的重疊峰得到了有效分離解析和定量測(cè)定。
表3 11批實(shí)際樣品解析結(jié)果
Tab. 3 Analysis results of 11 batch actual samples
注：＜0.01%是能檢出但低于定量限；DE是檢出；ND是未檢出
表4 Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)
Tab. 4 Wilcoxon test statistics
注：1）——基于負(fù)號(hào)的秩和統(tǒng)計(jì)量
3、 結(jié)語(yǔ)
探討了基于HPLC-DAD的完全重疊峰的分離解析方法。在對(duì)峰的整體純度進(jìn)行評(píng)價(jià)以后，尋找光譜穩(wěn)定區(qū)域，對(duì)得到的三維譜圖進(jìn)行背景補(bǔ)償和Savitzky-Golay平滑處理；利用二維相關(guān)光譜技術(shù)(2D-COS)提取特征光譜，利用導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖法(i-PDeA)提取特征原點(diǎn)波長(zhǎng)，提取被測(cè)組分在特征光譜原點(diǎn)波長(zhǎng)處的色譜圖，對(duì)色譜峰積分實(shí)現(xiàn)對(duì)完全重疊色譜峰的分離解析并定量測(cè)定。將該法用于測(cè)定染發(fā)劑中的對(duì)苯二胺和2，4-二氨基苯氧基乙醇胺鹽酸鹽完全重疊峰的解析定量分析，將解析結(jié)果和對(duì)照品的預(yù)處理光譜進(jìn)行比較，光譜圖相似度大于0.99，實(shí)現(xiàn)色譜峰自動(dòng)識(shí)別；利用解析分離后的色譜峰測(cè)定其含量，與色譜分離后測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較無(wú)顯著性差異，得了滿意的結(jié)果。結(jié)果表明，所建立的方法能夠有效分離HPLC-DAD采集的光譜具有明顯差異的完全重疊色譜峰，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜體系多組分完全重疊色譜峰的識(shí)別和定量測(cè)定，并實(shí)現(xiàn)了利用色譜工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、解析識(shí)別、定量分析一體化智能分析，簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)處理方法，提高了檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，該研究不僅為化妝品中安全風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)HPLC-DAD色譜-光譜庫(kù)的建立提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，并對(duì)多組分復(fù)雜基質(zhì)的紅外光譜、拉曼光譜、紫外-可見(jiàn)光譜等光譜解析提供思路。
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引用本文： 蘆麗，向健華，方方，等 . 二維相關(guān)光譜和導(dǎo)數(shù)光譜色譜圖法用于高效液相色譜二極管陣列色譜峰識(shí)別及解混［J］. 化學(xué)分析計(jì)量，2024，33（10）：86. (LU Li, XIANG Jianhua, FANG Fang, et al. Two dimensional correlation spectroscopy and derivative spectroscopy chromatography for peak identification and unmixing in high-performance liquid chromatography with diode array chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(10): 86.)
來(lái)源：化學(xué)分析計(jì)量
