您當前的位置：檢測資訊 > 科研開發
嘉峪檢測網 2025-01-23 19:36
本文以研究油浴儀法測定 D 值的影響因素為目的，采用殘存曲線法多次測定同一批嗜熱脂肪芽孢桿菌在氯化鈉注射液中的 D 值，根據不同條件下 D 值測定結果的比較，確定 D 值測定的影響因素。通 過比較 0.05 mL、0.5 mL、1.0 mL 三種菌液量，以及毛細管、安瓿瓶兩種分裝方式的測定結果發現，安瓿瓶分裝 0.5 mL 菌液 6 次測定 D 值均在標示 D 值的 80％～ 120％之間，測定結果準確穩定。因此，本文建議油浴儀測定 D 值時將菌液分裝在安瓿瓶中，每瓶分裝 0.5 mL，并關注油浴儀溫度的均勻性和穩定性。
在濕熱滅菌工藝中，可以通過檢驗生物指示劑滅菌后的存活情況來驗證滅菌效果 [1-5]。生物指示劑是指將特殊活微生物采用特定方法制備成對特定滅菌工藝有耐受性的一種生物制品，一般選用比普通微生物有更強耐受性的微生物[4]。生物指示劑目前主要有三種類型：芽孢懸液型、自含式、載體型生物指示劑 [6-10]。
評估生物指示劑的關鍵技術參數主要有總芽孢數、D 值。總芽孢數即產品存活孢子數。D 值指在一定暴露條件下，將試驗微生物殺滅 90% 所需的滅菌時間 / 劑量 [11-13]。D 值越大說明微生物死亡速率越慢，耐熱性也越強。D 值會受到菌種、細菌或芽孢菌懸液的性質、 滅菌溫度 / 劑量影響，不受初始細菌數量的影響。
D 值在滅菌設備的性能確認、特定滅菌工藝的開發、生產過程滅菌效果的檢測及評估方面具有重要作用。檢測 D 值的方法主要有陰性分數法和殘存曲線法 [14]，測定的 D 值應在標示 D 值的 80％～120％之內。
為驗證擬定的滅菌工藝是否能讓產品達到要求的無菌保證水平，本研究以油浴儀測定嗜熱脂肪芽孢桿菌在氯化鈉注射液中的 D 值為例，分析油浴過程并確定關鍵點，建立油浴儀殘存曲線法測定 D 值方法，測定嗜熱脂肪芽孢桿菌在氯化鈉注射液中的 D 值，并根據試驗結果指導產品滅菌工藝生物學挑戰驗證。
1、材料
本實驗主要使用以下試劑、培養基和儀器（見表 1、表 2、表 3、表 4）。
表 1 嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子懸液產品信息
表 2 試驗樣品
表 3 培養基
表 4 儀器
2、方法與結果
采用油浴儀測定嗜熱脂肪芽孢桿菌在氯化鈉注射液中的 D 值，分析油浴過程并確定關鍵點，建立油浴儀殘存曲線法測定 D 值方法。
2.1 油浴儀結構
油浴儀是一種可以設定 100℃以上的恒溫設備，由機箱、恒溫油槽、控溫系統等 3 部分組成。油浴儀以硅油為介質，控溫系統控制油浴儀的各個位置溫度的均一性。結構見圖 1。
圖 1 油浴儀結構圖
2.2 供試品 D 值測定試驗方法
菌液體積選擇 0.05 mL、0.5 mL、1 mL 三種，其中 0.05 mL 菌液每組共 6 支毛細管；0.5 mL 和 1 mL 菌液每組共 4 支。
2.2.1 孢子懸液的供試品溶液制備
取合格的孢子懸液，加入到氯化鈉注射液中，將孢子懸液制備成孢子數 為 5×105 ～ 5×106 cfu/mL 的供試品溶液。其中，0.05 mL/ 支毛細管的 D 值測定孢子懸液取樣體積為 0.05 mL ；安瓿瓶測定需要菌液體積孢子懸液體積分別為 0.5 mL 或 1 mL。
2.2.2 分裝和密封
采用注射器將 0.05 mL 菌液注射至毛細管中，采用移液器將 0.5 mL、1 mL 菌液轉移至安瓿瓶中。采用酒精噴燈對上述樣品進行封口，封口時避免酒精噴燈火焰對孢子造成損傷。封口后，進行封口效果檢測，排除漏液的樣品。
2.2.3 滅菌處理
將制備好的含孢子懸液的供試品分為 7 組，于 121℃恒溫油浴鍋中進行滅菌處理，每組滅菌時間分別為 0 min、 2.5 min、5 min、7.5 min、10 min、 12.5 min、19 min。滅菌后，樣品放入冰水中冷卻，并冷藏，在 2 h 內進行殘余孢子計數。
2.2.4 殘余孢子計數
將各試驗組樣品，置于超聲波儀上充分混勻，表面消毒后，取出供試品液 （盡可能全部取出，無明顯殘留）。未經滅菌處理的樣品在 95℃～ 100℃水浴熱 激 15 min（以供試品達到設定溫度開始 計時），熱激完成后取出樣品，迅速放入冰水中冷卻。采用 10 倍遞增稀釋法，逐級稀釋至適宜梯度進行計數，其余組混勻后直接稀釋計數。
2.2.5 數據處理
根據培養計數結果，取滅菌時間為橫坐標，存活孢子數的對數值為縱坐標作圖，D 值為該直線斜率的負倒數，計算嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子在溶液中的D 值。
計算公式：y= kx+b D121℃ = -1/k （式中：k 為直線方程式的斜率）。
結果判斷：計算出孢子懸液在產品介質溶液中的 D 值與孢子懸液標示 D 值比較，判斷所測 D 值是否在標示 D 值的 80% ～ 120% 范圍內，線性回歸 R2 需大于 0.80。
2.3 試驗結果
采用油浴儀對孢子懸液 D 值測定共 10 次：其中分裝 0.05 mL 菌液（采 用毛細管分裝）試驗 2 次；1 mL 菌液（采 用安瓿瓶分裝）試驗 2 次；0.5 mL 菌液 （采用安瓿瓶分裝）試驗 6 次。
2.3.1 0.05 mL 菌液 D 值測定結果
采用毛細管分裝 0.05 mL 菌液，樣品分為 7 組，每組 6 支，油浴后，進行殘余孢子數計數。共試驗 2 次，結果見表 5。
表 5 0.05 mL 菌液 D 值測定
2.3.2 1 mL 菌液 D 值測定結果
采用安瓿瓶分裝 1 mL 菌液，樣品分為 7 組，每組 4 支，滅菌時間間隔為 2.5 min，油浴后，進行殘余孢子數計數。共試驗 2 次，計數結果見表 6。
表 6 1 mL 菌液 D 值測定
2.3.3 0.5 mL 菌液 D 值測定結果
采用安瓿瓶分裝 0.5 mL 菌液，樣品分為 7 組，每組 4 支，滅菌時間間隔為 2.5 min，油浴后，進行殘余孢子數計數。共試驗 6 次，計數結果見表 7。
表 7 0.5 mL 菌液 D 值測定
2.3.4 D 值計算
取滅菌時間為橫坐標，存活孢子數的對數值為縱坐標，D 值為該直線斜率的負倒數，計算公式：y=kx+b，D121℃ = -1/k （式中：k 為直線方程式的斜率）。D 值計算結果見表 8。
表 8 D 值計算結果
3、討論
3.1 D 值測定結果分析
根據油浴儀殘存曲線法 D 值測定結果分析，由表 8 可知：采用 0.5 mL 菌液體積的試驗，測定 D 值為標示 D 值的 91%、119%、110%、 111%、115%、113%，均在標示值的 80% ～ 120% 之間，而采用 0.05 mL 菌液體積測定 D 值為標示 D 值的 124%、148%，采用 1 mL 菌液體積測定 D 值為標示 D 值的 145%、156%， 均未在標示 D 值的 80% ～ 120% 之間。因此采用 0.5 mL 菌液體積進行 D 值測定較好，測定 D 值更準確。
3.2 不同菌液量之間的比較
不同的菌液體積影響了菌液的分裝載體，0.05 mL 菌液體積采用毛細管分裝，0.5 mL 和 1 mL 菌液采用安瓿瓶進行分裝。①樣本用量比較：采用毛細管進行 D 值測 定，每組樣品≥ 6 支，安瓿瓶每組樣品≥ 4 支，在分裝次數上安瓿瓶分裝次數少于毛細管，但總體積為毛細管最少。②分裝方法比較：毛細管采用注射分裝體積，分裝時針頭需伸入毛細管中，而安瓿瓶采用移液器進行分裝，因此采用安瓿瓶分裝比毛細管分裝更簡便。③載體比較：載體不同也會對樣品孢子回收率產生影響，毛細管體積少，回收困難，回收率低。④油浴溫度的影響：菌液體積越大吸收的熱量越多，對油浴溫度的影響也越大，對樣品的滅菌效果出現較大的影響。
3.3 儀器性能對于 D 值測定的影響
影響測定嗜熱脂肪芽孢桿菌在氯化鈉注射液中 D 值的主要因素為溫度、時間，而其中溫度對于滅菌效果的影響非常顯著。采用油浴儀進行 D 值測定，油浴儀對溫度穩定控制較弱，采用循環管道平衡各位置的溫度，受循環泵和硅油流動速度的影響，油浴儀各位置溫度均一性較差。由于油浴儀內的樣品放置的位置不同，因此每個樣本所處位置的溫度不完全一致，放入樣品后，吸收熱量導致局部溫度出現下降， 滅菌效果下降，可能會對測試結果有一定影響。這也可能是上述實驗結果中測定的 D 值均比標示 D 值大的原因之一，真實值比測定值小，出現誤差。因此，測定 D 值所需的硬件設備對于 D 值測定準確性至關重要。
參考文獻
[1] 張啟林，林晶晶 . 濕熱滅菌工藝 驗證探討 [J]. 中國醫藥工業雜志， 2021，52(08):1106-1114.
[2] 韓晗，徐敏鳳，魏佳鳴 . 濕熱滅 菌課題的相關研究與思考 [J]. 中 國 藥 品 標 準，2019，20(04):298- 304.
[3] 肖 璜， 馬 仕 洪， 崔 強 等 . 應 用 于濕熱滅菌的生物指示劑現狀與 分析 [J]. 微生物學雜志，2014， 34(04):77-79.
[4] 尚海濱 . 壓力蒸汽滅菌法在中藥制 劑生產中的應用 [J]. 機電信息， 2013(26):33-3851.
[5] 陳世鵬，董炎超 . 應用生物指示劑 驗證蒸汽滅菌器的滅菌效果 [J]. 流程工業，2021(7):51-53.
[6] 胡昌勤 . 藥品微生物控制體系建設 現狀與展望 [J]. 中國現代應用藥 學，2021，38(05):513-519.
[7] The United States Pharmacopeial Convention.USP36-NF31,1[M］. U n i t e d S t a t e s : U n i t e d B o o k press,2012: 536-539.
[8] 醫療保健產品滅菌生物指示劑選擇 / 使用及檢驗結果判斷指南 [S]. GB/T 19972-201805/ISO 14161：2009.
[9] 醫療保健產品滅菌生物指示物第 1 部分通則 [S].GB 18281.1-2015/ISO 11138-1：2006.
[10] 龔海燕，張明，李倩等 . 滅菌生物 指示劑與指示微生物 [J]. 環境衛生 學雜志，2013，3(02):170-174.
[11] XIAO H, GUO Z L, XIA M F, et al. Investigation of spore counting methods using self-contained pressure biological indicator for steam sterilization [J]. China Pharm( 中國藥 師 )，2015，18(7)：1110-1112.
[12] 朱冉，許華玉，宋宗華 .2020 年版 《中國藥典》四部微生物控制體 系的增修訂概況及展望 [J]. 中國藥 學雜志，2020，55(19):1564-1568.
[13] 中國藥典 2020 版第四部 9208 生 物指示劑耐受性檢查法指導原則
[14] 馬仕洪，王似錦，熊駿等 . 陰性 分數法和殘存曲線法測定濕熱滅 菌用自含式生物指示劑 D 值的比 較 [J]. 中國醫藥工業雜志，2018， 49(05):667-671.
本文作者申景豐，蔣芙蓉， 湯平， 余衛國，夏博， 陳超，僅供交流學習。
來源：制藥工藝與裝備
