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嘉峪檢測網 2025-02-17 20:39
摘 要： 建立高效液相色譜法同時測定人參屬植物中9種人參皂苷含量。經Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱分離，以乙腈-0.1%（體積分數）磷酸水溶液作為流動性進行梯度洗脫，流量為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為203 nm。結果表明，9種人參皂苷標準品在各自質量濃度范圍內與色譜峰面積線性關系良好，相關系數均大于0.999，檢出限為0.005～0.035 mg/mL。在低、中、高三個濃度加標水平下，樣品平均加標回收率為98.12%～101.94%，測定結果的相對標準偏差為2.50%～8.85%（n=6）。該方法簡便快速、分離度好、重現性好、精密度高、結果可靠，可用于人參屬植物中9種人參皂苷含量的同時測定。
關鍵詞： 高效液相色譜法； 人參皂苷； 人參； 西洋參； 三七
人參皂苷是一種固醇類天然產物，是人參、西洋參、三七等五加科人參屬藥材的主要活性成分[1],具有抗炎、抗衰老、抗腫瘤和防治心腦血管疾病的作用[2]。不同的人參皂苷具有不同的抗癌活性，其中人參皂苷Rb1具有保護心肌細胞、抗炎作用[3-4]；人參皂苷Rb2具有抗高血糖、高脂血癥作用[5]；人參皂苷Rb3能夠提高心肌細胞收縮力[6]；人參皂苷Rc具有保護神經系統的作用[7]；人參皂苷Rd具有鎮痛的作用[8]；人參皂苷Re具有抗氧化的作用[9]；人參皂苷Rg1具有修復神經損傷的作用[10]；人參皂苷Rg2具有抗氧化和抗細胞凋亡的作用[11]；人參皂苷Rg3具有抗腫瘤的作用[12]。臨床中人參皂苷的生物利用度低，需求量大，對人參、西洋參，三七中人參皂苷的含量進行比較，旨在為提高人參皂苷生物利用度提供參考，同時降低臨床應用成本。
目前報道的人參皂苷含量測定方法主要是高效液相色譜（HPLC）法[13-14]，但存在無法同時測定多種人參皂苷含量的問題。雖然有文獻報道利用液相色譜-串聯質譜法可以測定6種人參皂苷的含量[15-18]，但此方法不僅成本相對較高，而且某些樣品在負離子模式下不易離子化，響應信號較差。謝海龍等[19]利用HPLC測定人參皂苷含量方法僅適用于某些特定的人參皂苷，對于同時測定多種人參皂苷含量的效果有限。筆者通過篩選色譜柱和優化色譜條件，建立了用高效液相色譜法同時測定人參屬植物中9種人參皂苷的含量。該方法專屬性強、準確度高，節約了測定成本，擴大了檢測范圍，適用于人參屬植物中人參皂苷的定性與定量分析。
1、 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
電子天平：JF2004型，感量為0.000 1 g，余姚市金諾天平儀器有限公司。
數控超聲波清洗器：KQ-300DE型，昆山市超聲儀器有限公司。
高效液相色譜儀：Agilent 1260 Infinity II型，美國安捷倫科技有限公司。
人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rg3對照品：純度(質量分數)均為99.7%，上海源葉生物科技有限公司。
西洋參皂苷、人參皂苷提取物樣品：批號分別為230701、230707，吉林省宏久生物科技股份有限公司。
三七皂苷提取物樣品：批號為230709，四川勝仁生物科技有限公司。
甲醇、乙腈：均為色譜純，純度(質量分數)為99.9%，美國天地有限公司。
磷酸：分析純，純度(質量分數)為99.0%，國藥集團化學試劑有限公司。
0.1%磷酸水溶液：量取1 000 ml蒸餾水，置于1 000 ml燒杯中，加入1 ml磷酸。
實驗用水：純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。
1.2 儀器工作條件
色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；檢測波長：203 nm；柱溫：35 ℃；進樣體積：10 μL；流動相：A相為乙腈，B相為0.1%磷酸水溶液，流量為1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
Tab. 1 Gradient elution procedure
1.3 實驗方法
1.3.1 樣品的選擇
王洪峰等[20]研究發現，人參皂苷Rg3較為罕見，只有發酵后才會促進常見皂苷向稀有皂苷Rg3的轉化，與陳爽等[21]的研究結果是一致的。此外，徐士奎等[22]、謝海龍等[19]在穩定性試驗中發現人參皂苷提取物的穩定性好，不存在未經外力作用下相互轉化的情況。張姝妍等[23]利用高效液相色譜法同時測定不同生長年限的三七中人參皂苷的含量，發現三七的生長年限對人參皂苷含量有顯著影響。蒙蒙等[24]的研究同樣表明，不同產地及年限的三七，均影響人參皂苷的含量，因此最終選擇人參、西洋參、三七3種不同樣品進行人參皂苷含量測定，以確保方法的可行性和準確度。
1.3.2 系列混合對照品溶液的制備
分別精密稱取人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rg3對照品4.00、6.00、7.00、7.00、7.00、6.00、7.00、7.00、7.00 mg，置于5 mL離心管中，加入5.00 mL甲醇溶解記為S1，取S1 2.50 mL加入2.50 mL甲醇溶解記為S2，取S2 2.50 mL加入2.50 mL甲醇溶解記為S3，取S3 2.50 mL加入2.50 mL甲醇溶解記為S4，取S4 2.50 mL加入2.50 mL甲醇溶解記為S5，取S5 2.50 mL加入2.50 mL甲醇溶解記為S6，系列混合對照品溶液的配制濃度見表2。
表2 系列混合對照品溶液的配制濃度
Tab. 2 Preparation concentrations of the series of mixed standard solutions
1.3.3 樣品溶液的制備
精密稱取西洋參皂苷提取物、人參皂苷提取物、三七皂苷提取物40.00 mg各6份，分別置于10 mL離心管中，加入5.00 mL甲醇溶解，超聲20 min，將配好的溶液經液相濾膜過濾，置于5 mL的容量瓶中定容，取1 mL加入到液相玻璃瓶中，作為樣品溶液。
1.3.4 實驗步驟
在1.2儀器工作條件下，將6種濃度的混合對照品溶液分別進樣測定，以目標物的質量濃度為橫坐標，對應的色譜峰面積為縱坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線，將對應目標物色譜峰面積代入標準曲線線性方程，得到目標物的質量濃度，再計算得到樣品中目標物的質量分數。
2、 結果與討論
2.1 色譜柱選擇
高效液相色譜法測定樣品含量時，色譜柱的選擇尤為重要[25]，其填料直接影響測定結果的準確性。通過比較C18 (ODS)和C8 (MOS) 2種不同填料的色譜柱，發現C18色譜柱對于目標成分的保留效果和分離效果最好。C8色譜柱的固定相為辛基官能團，其疏水性相較于C18色譜柱較弱，保留能力也相對較低。由于人參皂苷的水溶性較差，在C8色譜柱中的保留時間較短，未能完全分離人參皂苷Rg1與Re，以及Rg2與Rb1。因此選擇ZORBAX SB-C18色譜柱，以確保人參皂苷的有效分離和精確測定。
2.2 流動相優化
2020年版《中華人民共和國藥典》[26]中報道了一種人參皂苷Rg1、Re、Rb1為對照品的洗脫方法，但對其他人參皂苷的分離效果較差。為改善分離效果，對流動相進行了系統優化，增加了梯度洗脫步驟，逐步調整流動相比例，以提高9種人參皂苷的分離度并減少其他物質的干擾。分別考察了乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液2種流動相的分離效果，并對不同的梯度洗脫條件下待測成分色譜峰在分離度、純度和峰形等方面進行綜合比較。結果表明，使用0.1%磷酸水溶液作為流動相時，樣品溶解度最佳，基線平穩，9種目標化合物的分離度良好且峰形較佳。
在考察最優流動相洗脫比例時，發現當流動相B的比例減少5%時，色譜峰保留時間延長，但人參皂苷Rg1和Re仍無法完全分離；當流動相B的比例增加5%時，色譜峰保留時間縮短，導致人參皂苷Rg1與Re、Rg2與Rb1、Rb2與Rb3發生重疊，無法完全分離。在表1所示的最佳梯度洗脫條件下，最難分離的皂苷Rg1與Re的分離度達到1.8，表明該方法具有良好的分離效果和較高的測定效率，且操作簡便，適用于人參皂苷的分離與測定。
2.3 檢測波長選擇
9種人參皂苷主要來自人參、西洋參、三七3種樣品，檢測波長的確定參考了2020年版《中華人民共和國藥典》[26]中收載的用HPLC法測定人參、西洋參、三七中人參皂苷的含量的方法，并結合多篇文獻報道[15-17]，最終確定檢測波長為203 nm。
2.4 專屬性考察
分別取混合對照品溶液、樣品溶液和加標樣品溶液，在1.2儀器工作條件下進行測定，色譜圖如圖1~4所示。從圖1~3中可以看出，樣品溶液中各成分色譜峰峰形良好，對應色譜峰保留時間與圖4中相應對照品溶液一致。從圖4中可以看出，9種人參皂苷的保留時間分別約為：Rg1 33 min、Re 34 min、Rg2 64 min、Rb1 68 min、Rc 71 min、Rb2 74 min、Rb3 75 min、Rd 79 min、Rg3 86 min，其中人參皂苷Rg1、Re的分離度為1.8大于1，兩峰能夠有效分離；人參皂苷Rb2、Rb3的分離度為3.13大于1，兩峰完全分離。9種人參皂苷的色譜峰峰形良好，且樣品溶液基質無干擾，滿足測定要求，表明該方法專屬性良好。
圖1 西洋參皂苷提取物樣品色譜圖與加標樣品色譜圖
Fig. 1 Chromatogram of the ginsenoside extract sample from American Ginseng and the spiked sample
1—人參皂苷Rg1；2—人參皂苷Re；3—人參皂苷Rg2；4—人參皂苷Rb1；5—人參皂苷Rc；6—人參皂苷Rb2；7—人參皂苷Rb3；8—人參皂苷Rd
圖2 人參皂苷提取物樣品色譜圖與加標樣品色譜圖
Fig. 2 Chromatogram of the Ginsenoside extract sample and the spiked sample
1—人參皂苷Rg1；2—人參皂苷Re；3—人參皂苷Rg2；4—人參皂苷Rb1；5—人參皂苷Rc；6—人參皂苷Rb2；7—人參皂苷Rb3；8—人參皂苷Rd
圖3 三七皂苷提取物樣品色譜圖與加標樣品色譜圖
Fig. 3 Chromatogram of Panax Notoginseng sample and the spiked sample
1—人參皂苷Rb1；2—人參皂苷Rc；3—人參皂苷Rb2；4—人參皂苷Rb3；5—人參皂苷Rd；6—人參皂苷Rg3
圖4 人參皂苷混合對照品溶液色譜圖
Fig. 4 Chromatogram of the mixed Ginsenoside reference solution
1—人參皂苷Rg1；2—人參皂苷Re；3—人參皂苷Rg2；4—人參皂苷Rb1；5—人參皂苷Rc；6—人參皂苷Rb2；7—人參皂苷Rb3；8—人參皂苷Rd；9—人參皂苷Rg3
2.5 線性方程與方法檢出限
取系列混合人參皂苷對照品溶液，在1.2儀器工作條件下進樣測定，以人參皂苷濃度(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，繪制標準工作曲線，計算線性方程和相關系數。將對照品儲備液不斷稀釋并檢測，分別以3倍信噪比和10倍信噪比對應的質量濃度分別作為方法檢出限和定量限，9種人參皂苷質量濃度的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限見表3。由表3可知，9種人參皂苷的質量濃度在各自范圍內與色譜峰面積線性關系良好，相關系數均大于0.999，檢出限為0.005~0.035 mg/mL，定量限為0.015~0.105 mg/mL。
表3 9種人參皂苷質量濃度的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限
Tab. 3 The linear range，linear equation，correlation coefficient，limit of detection，and limit of quantification for the nine Ginsenosides.
2.6 精密度試驗
按1.3.2方法將人參、西洋參、三七樣品分別制備6份樣品溶液，在1.2色譜條件下進樣測定，根據所得色譜峰面積計算9種人參皂苷含量的相對標準偏差(RSD)，精密度試驗結果見表4。由表4可知，人參皂苷提取物、西洋參皂苷提取物、三七皂苷提取物中9種人參皂苷含量的RSD均小于10.00%，表明該方法重復性好、精密度較高，能夠滿足實驗室日常檢測要求。
表4 精密度試驗結果
Tab. 4 Results of precision test
2.7 樣品加標回收試驗
精密稱取商品化的西洋參皂苷提取物、人參皂苷提取物、三七皂苷提取物40.00 mg各6份，分別置于10mL的離心管中，分別加入相當于各目標成分已知量的150%的對照品，按照1.3.2方法制備加標樣品溶液，每種人參皂苷平行測定6次[22,24]，在1.2儀器工作條件下，依次測定并計算樣品加標回收率，加標回收試驗結果見表5~7，由表5~7可知，3種提取物中人參皂苷的樣品平均加標回收率為98.12%~101.94%，表明該方法的樣品加標回收率良好。
表5 西洋參皂苷提取物樣品加標回收試驗結果
Tab. 5 Results of the spiked recovery test for American Ginseng saponin extract sample.
表6 人參皂苷提取物樣品加標回收試驗結果
Tab. 6 Results of the spiked recovery test for Ginsenoside extract sample
表7 三七皂苷提取物樣品加標回收試驗結果
Tab. 7 Results of the spiked recovery test for Notoginsenoside extract sample
3、 結語
通過優化色譜條件，建立了高效液相色譜法同時測定在人參屬植物中同時測定9種人參皂苷。該方法分離效率高、專屬性強、精密度好，可以為人參屬植物中人參皂苷的含量測定提供方法支撐，可為人參屬中藥質量控制大大減少檢測成本。
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引用本文： 張月如，趙景瑩，湯慧麗，等 . 高效液相色譜法測定人參屬植物提取物中9種人參皂苷［J］. 化學分析計量，2024，33（11）：26. (ZHANG Yueru, ZHAO Jingying, TANG Huili, et al. Determination of 9 Ginsenosides in extracts of Panax species by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(11): 26.)
來源：化學分析計量
