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嘉峪檢測網(wǎng) 2024-11-26 08:24
摘 要： 建立高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法定量分析人參組培不定根中11種皂苷成分。樣品經(jīng)粉碎研磨，以70%甲醇水溶液為溶劑進行超聲提取，離心過濾后測定。采用C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），用水和乙腈進行梯度洗脫，流量為0.3 mL/min，柱溫為35 ℃。質(zhì)譜采用電噴霧電離源，負離子掃描，多反應監(jiān)測模式進行檢測。11種皂苷的質(zhì)量濃度在0.1～10 μg/mL（Rb1為0.2～10 μg/mL）范圍內(nèi)和響應強度線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，各皂苷的定量限為0.001～0.010 g/kg，加標回收率為90.43%～97.82%，相對標準偏差為1.93%～6.33%（n=6）。該方法操作簡單，分析時間短，靈敏度高，準確可靠，適用于人參組培不定根中多種皂苷類成分的同時測定。
關(guān)鍵詞： 高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法； 人參組培不定根； 皂苷
藥用植物人參為五加科人參屬植物[1]，現(xiàn)代研究認為，人參的主要藥理活性物質(zhì)為人參皂苷，它們不僅可以調(diào)節(jié)血壓、保護神經(jīng)系統(tǒng)、增強免疫系統(tǒng)等，還表現(xiàn)出抗腫瘤、抗衰老及抗氧化等多種活性[2?5]。然而人參生長緩慢，種植年限長，對環(huán)境條件要求嚴格，栽培技術(shù)復雜，生產(chǎn)受到很大限制。人參組培不定根是利用植物細胞的全能性，由人參外植體在培養(yǎng)基中誘導出愈傷組織，經(jīng)過增殖、定向誘導等步驟形成的不定根[6?7]。它既可實現(xiàn)人參種苗的快速繁殖，又可快速獲取人參的次生代謝產(chǎn)物，給藥用人參資源可持續(xù)利用帶來廣闊的前景，因此，對人參不定根開展皂苷活性成分的檢測是利用組織培養(yǎng)技術(shù)研究人參藥材生產(chǎn)栽培、開發(fā)利用的基礎(chǔ)和前提。
在以往的研究中，往往通過測定皂苷類成分的總量來評估人參組培不定根的品質(zhì)，缺少對各個皂苷單體的含量測定。人參皂苷種類繁多，目前已發(fā)現(xiàn)單體皂苷超過60種，主要包括原人參二醇型、原人參三醇型和齊墩果酸型等[8]。在現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》(2020版)中，對人參皂苷Rb1、Re和Rg1三種主要成分制定了限量指標[9]，但還是缺少其他皂苷指標的檢測，因而無法完全實現(xiàn)人參及其培養(yǎng)體藥材的質(zhì)量控制和品質(zhì)評價等需求。高效液相色譜法(HPLC)已被廣泛用于人參皂苷的含量測定研究[10?12]，高效液相色譜與高分辨質(zhì)譜的結(jié)合(如HPLC-Q/TOFMS、HPLC-Q/OrbitrapMS)已越來越多地應用于人參皂苷的定性研究和結(jié)構(gòu)鑒定[13?15]。然而，人參皂苷顯示出低波長紫外吸收特征，導致使用HPLC進行檢測時基線噪聲增加和靈敏度降低，同時分析時間過長，而基于高分辨質(zhì)譜的分析無法實現(xiàn)人參皂苷的絕對定量。上述方法在同時量化多種皂苷成分時均有明顯缺陷，不利于從整體揭示藥材的化學特征。目前，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)是復雜基質(zhì)樣品中多種微量目標物確認和準確定量的主流方法[16?18]，通過多重反應監(jiān)測模式，在不需要完全分離目標物的情況下實現(xiàn)定性定量檢測，同時大大縮短分析時間，提高檢測的靈敏度和數(shù)據(jù)質(zhì)量的穩(wěn)定性。筆者采用簡單的甲醇超聲提取處理方式，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速、準確、專屬性強的優(yōu)勢，建立了人參組培不定根中11種皂苷的含量測定方法，為人參的育種繁殖、資源利用提供技術(shù)保障。
1、 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：6460型，配有AJS-ESI離子源，美國安捷倫科技有限公司。
臺式高速冷凍離心機：CF16RXII型，日本日立公司。
多用途渦旋混合器：SAS型，英國Stuart公司。
超聲波清洗器：KQ3200型，昆山超聲儀器有限公司。
氮吹儀：MFV-24型，廣州得泰儀器科技有限公司。
電子天平：Quintix型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯公司。
人參皂苷：Rg1，質(zhì)量分數(shù)為98.5%，批號為110703-202235；Rg3，質(zhì)量分數(shù)為99.5%，批號為110804-201504；Re，質(zhì)量分數(shù)為96.0%，批號為110754-202129；Rb1，質(zhì)量分數(shù)為95.1%，批號為110704-202230；Rb2，質(zhì)量分數(shù)為93.8%，批號為111715-202104；Rb3，質(zhì)量分數(shù)為96.5%，批號為111686-202306；Rd，質(zhì)量分數(shù)為97.3%，批號為111818-202305；Rh2 (S)，質(zhì)量分數(shù)為95.8%，批號為111748-202102，中國食品藥品檢定研究院。
人參皂苷：Rg2，質(zhì)量分數(shù)為92.4%，批號為C0007325；Rf，質(zhì)量分數(shù)為92.6%，批號為C0006815，曼哈格(上海)生物科技有限公司。
人參皂苷：Rc，質(zhì)量分數(shù)為99.9%，批號為FS1617362，天津阿爾塔科技有限公司。
正丁醇、三氯甲烷：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。
乙腈、甲醇；均為質(zhì)譜級，美國賽默飛世爾科技有限公司。
人參組培不定根樣品：北京斯誕安普科技有限公司。
實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)過濾的超純水。
1.2 儀器工作條件
1.2.1 色譜儀
色譜柱：Water BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國沃特世公司)；柱溫：35 ℃；進樣體積：5 μL；流動相：A相為水，B相為乙腈，流量為0.3 mL/min；梯度洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
Tab. 1 Gradient elution conditions
1.2.2 質(zhì)譜儀
離子源：電噴霧離子源(AJS-ESI源)；電離方式：負離子；毛細管電壓：4.0 kV；干燥器溫度350 ℃；干燥器流量8 L/min；霧化器壓力0.2 MPa；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)模式；MRM監(jiān)測離子對參數(shù)如表2所示。
表2 11種分析物質(zhì)譜參數(shù)列表
Tab. 2 MS/MS determination parameters of 11 analytes
注：*為定量離子
1.3 標準溶液制備
單標儲備液：分別準確稱取11種皂苷標準品約10 mg (精確到0.01 mg)，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至標線，得到質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL的單標儲備液，于-20 ℃保存。
混合標準儲備液：分別精密移取上述單標儲備液各1 mL至同一100 mL容量瓶中，用甲醇定容至標線，搖勻，得質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標準儲備液，于-20 ℃保存。
系列混合標準工作溶液：準確移取上述混合標準儲備液適量，用甲醇逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、5、10 μg/mL 6種濃度的系列混合標準工作溶液，臨用前現(xiàn)配。
1.4 實驗方法
1.4.1 樣品處理
取人參組培不定根樣品適量，粉碎并充分混勻，過250 μm篩。準確稱取過篩后的樣品粉末0.1 g (精確至0.001 g)，置于15 mL離心管中，精密加入70%(體積分數(shù)，下同)甲醇水溶液5 mL，渦旋混勻1 min，在60 ℃下加熱超聲提取60 min，冷卻后稱重用70%甲醇水溶液補足重量。以3 000 r/min離心10 min后，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，必要時稀釋5倍，上機測定。
1.4.2 樣品測定
按儀器參考條件設(shè)定，將系列標準混合溶液和試樣溶液等體積進樣測定，得到相應的標準溶液的色譜峰面積，以皂苷標準溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，以保留時間和相對豐度比同時定性，外標法定量。
2、 結(jié)果與討論
2.1 樣品處理條件的選擇
2.1.1 提取溶劑的選擇
在實驗過程中，人參皂苷的提取效率是準確定量的關(guān)鍵。目前常用的提取溶劑包括甲醇、水、不同比例的甲醇水溶液和水飽和的正丁醇，其中水飽和的正丁醇也是現(xiàn)行藥典規(guī)定的標準方法[9]。筆者通過研究發(fā)現(xiàn)，采用70%甲醇水溶液提取與水飽和的正丁醇提取結(jié)果基本一致，但檢測的偏差較小，可能原因是水飽和的正丁醇提取過程涉及蒸干及復溶等步驟，復雜且容易引入誤差。考慮到采用70%甲醇水溶液提取可以簡化實驗過程，降低能耗，因此選擇該溶劑作為提取溶劑。70%甲醇水溶液提取與水飽和的正丁醇提取結(jié)果見圖1。
圖1 不同溶劑提取樣品測定結(jié)果
Fig. 1 Determination results of samples extracted by different solvents
2.1.2 提取時間、溫度的選擇
在確定70%甲醇水溶液作為提取溶劑后，對影響提取效率的主要因素提取時間和提取溫度進行了進一步考察。選擇10、20、40、60、80 min 5個時間點，選擇25、40、60、80 ℃ 4個溫度條件。研究發(fā)現(xiàn)，Rg1、Rg2、Rg3、Rh2、Rf 5種皂苷在40 min后即可提取完全，而其他幾種皂苷在60 min后提取較為完全，提取80 min后各種皂苷成分含量未有明顯變化，最終選擇60 min作為最佳提取時間(60 ℃條件下)，結(jié)果詳見圖2。通過對4個提取溫度進行比較，隨著溫度的升高皂苷含量略有增加，60 ℃時達到峰值且結(jié)果穩(wěn)定，同時60 ℃也是人參藥材常用的干燥條件，因此選擇皂苷提取溫度為60 ℃。
圖2 不同提取時間對應的樣品測定結(jié)果（60 ℃）
Fig. 2 Determination results of samples corresponding to different extraction time （60 ℃）
2.2 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化
2.2.1 色譜條件
人參皂苷大多含有由30個碳原子排列成4個環(huán)的甾烷類固醇核，是由糖和苷元相連而成的糖苷類化合物[13]。因其結(jié)構(gòu)相似，同分異構(gòu)體較多，色譜分離有一定困難。試驗比較了正、負兩種離子監(jiān)測模式采集皂苷類成分，其中負離子的響應強度較高，且更易形成準分子離子峰；比較了負離子監(jiān)測模式常用的乙腈-水、乙腈-水(含5 mmol/L甲酸銨)流動相體系，結(jié)果表明乙腈-水流動相體系的響應較高；同時細化梯度洗脫程序，以實現(xiàn)分離效果；考察了HPLC系統(tǒng)中常用的C18色譜柱Waters BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，其中Waters BEH C18柱分離效果較好，理論塔板數(shù)較高，且化合物的峰形較尖銳，對于Rb2和Rb3兩種較難分離的同分異構(gòu)體能實現(xiàn)基線分離，最終色譜條件見1.2.1。11種皂苷化合物的提取離子流色譜圖見圖3。
圖3 11種皂苷混合標準溶液的提取離子流色譜圖
Fig. 3 Extraction ion chromatograms of mixed standard solutions of 11 saponins
2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
選擇1.0 μg/mL混合標準溶液，采用安捷倫科技有限公司自帶的Optimizer優(yōu)化軟件，通過兩通進樣方式對目標化合物進行質(zhì)譜條件的摸索，主要包括母離子的選擇、去簇電壓的優(yōu)化、碰撞能的優(yōu)化和子離子的選擇。筆者發(fā)現(xiàn)，皂苷類化合物因其相對分子質(zhì)量較高，需要設(shè)置較大的去簇電壓，去簇電壓在175～200 V范圍效果較好；11種皂苷分子(M)中，除Rh2容易形成加和羧基(M+COOH)的準分子離子峰，其他化合物都易形成減氫(M-H)的準分子離子峰；通過對質(zhì)譜二級碎片裂解規(guī)律的解析，發(fā)現(xiàn)皂苷類結(jié)構(gòu)容易斷開脫水葡萄糖分子而形成一系列特征碎片離子，如人參三醇型皂苷(Rg1、Re等)容易產(chǎn)生質(zhì)荷比637、475的碎片離子，人參二醇型皂苷(Rb1、Rc等)容易產(chǎn)生質(zhì)荷比783、621的碎片離子。以Rg1的質(zhì)譜碎片為例，其典型的碎片離子為637[M-H-(glc-H2O)]-、475[M-H-2 (glc-H2O)]-、179[glc-H]-等，具體質(zhì)譜裂解規(guī)律見圖4。選擇相對分子質(zhì)量較大且響應較強的碎片離子作為離子對進行定量試驗；接著對11種皂苷化合物的碰撞能進行優(yōu)化，皂苷類化合物均需要較高的碰撞能量產(chǎn)生穩(wěn)定的碎片離子，從而實現(xiàn)儀器最優(yōu)的靈敏度。最終確定的皂苷化合物質(zhì)譜參數(shù)詳見表2。
圖4 負離子模式下Rg1的二級質(zhì)譜圖及質(zhì)譜裂解途徑
Fig. 4 MS/MS spectrum and mass fragmentation behavior of Rg1 in the negative ion mode
2.3 基質(zhì)效應的考察
液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測復雜基質(zhì)樣品時，檢測結(jié)果的準確性易受基質(zhì)效應的干擾，為此考察了人參組培不定根樣品的基質(zhì)效應(ME)對皂苷類物質(zhì)的影響。稱取樣品適量(約1.0 g)，以甲醇為提取溶劑，在80 ℃條件下索氏提取8 h，期間每隔2 h更換甲醇。回流后殘渣于60 ℃烘干，得空白基質(zhì)樣品，經(jīng)檢測不含皂苷類成分。按照1.4.1方法提取空白基質(zhì)樣品，平行制備基質(zhì)標準溶液和溶劑標準溶液，通過計算基質(zhì)標準曲線(校準曲線)線性方程斜率和溶劑標準曲線(標準曲線)線性方程斜率之比來評價基質(zhì)效應的程度。當ME為85%～120%時，表明基質(zhì)效應在可接受范圍內(nèi)，在實際檢測中可以忽略基質(zhì)效應，反之則應考慮基質(zhì)效應對實際檢測的影響。11種皂苷成分的ME計算見表3，ME結(jié)果為87.8%～96.1%，表明人參組培不定根中基質(zhì)效應不明顯，在實際檢測中可使用標準曲線進行定量檢測。
表3 11種皂苷成分的基質(zhì)效應
Tab. 3 Matrix effect results for 11 saponins
2.4 線性范圍和檢出限
采用HPLC-MS/MS法分別測定人參皂苷系列混合標準工作溶液，以目標物的色譜峰面積為縱坐標y，以目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標x，繪制標準曲線。11種化合物在曲線線性范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.995。當樣品取樣量為0.1 g，定容體積5 mL，以信噪比為3和10時的進樣質(zhì)量濃度點為儀器的最低檢出含量和最低定量含量，最終計算方法的檢出限、定量限詳見表4。
表4 11種分析物的質(zhì)量分數(shù)線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限
Tab. 4 Linear range, linear equation, correlation coefficient, LODs and LOQs of 11 analytes
2.5 樣品加標回收試驗率
取人參組培不定根樣品一批，平行稱量18份，每份稱取約0.1 g，3個濃度水平分別加入質(zhì)量濃度為10 μg/mL混合標準溶液100、400、1 000 μL，每個水平取樣6次，按該方法進行測定，結(jié)果見表5。由表5可見，11種皂苷類物質(zhì)的平均回收率為90.43%～97.82%，相對標準偏差(RSD)為1.93%～6.33%，滿足微量物質(zhì)的檢測需求。11種皂苷標準溶液的多反應監(jiān)測色譜圖詳見圖5。
表5 11種分析物的樣品加標回收試驗結(jié)果
Tab. 5 Spiked recovery results of 11 analytes samples
圖5 11種皂苷標準溶液的MRM色譜圖
Fig. 5 MRM chromatograms of 11 standard saponins solution
2.6 實際樣品測定
取北京斯誕安普科技有限公司提供的人參組培不定根樣品6批次，按照該方法進行測定，結(jié)果見表6。由表6可以看出，人參組培不定根樣品中各皂苷成分與種植人參中有明顯差別，其中Rg3和Rh2兩種成分顯著高于種植人參，其他皂苷成分略低于種植人參，各批次均未檢測到Rb3成分。表明組培技術(shù)培養(yǎng)的人參與種植人參在單體皂苷成分上有明顯不同，可通過調(diào)整培養(yǎng)液、培養(yǎng)環(huán)境等手段進一步研究組培技術(shù)在人參培養(yǎng)中的應用。
表6 人參組培不定根樣品中皂苷成分測定結(jié)果
Tab. 6 saponins results in the tissue culture roots of ginseng
3、 結(jié)語
利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)建立了人參組培不定根樣品中11種皂苷類成分含量的檢測方法。該方法操作簡單、分析時間短，測定結(jié)果準確，適用于人參組培不定根中多種皂苷成分的測定，為組培技術(shù)在人參藥材中的生產(chǎn)栽培、資源利用提供保障。
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引用本文： 董喆，王玉梅，孫姍姍，等 . 高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測定人參組培不定根中11種皂苷成分［J］. 化學分析計量，2024，33（10）： 55. (DONG Zhe, WANG Yumei, SUN Shanshan, et al. Determination of 11 saponins in adventitious roots of ginseng tissue cultures by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(10): 55.)
來源：化學分析計量
