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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-03-06 17:19
脂肪酸是由鏈烴和羧基構(gòu)成的一類羧酸化合物，在動物、植物、微生物中廣泛存在，是有機體中性脂、磷脂和糖脂等的重要組成成分，參與包括能量代謝、免疫調(diào)節(jié)、生理病變等多種生命活動。
結(jié)合化學結(jié)構(gòu)，主要通過3方面，即脂肪碳鏈的長短和連接方式、雙鍵數(shù)目和位置，以及雙鍵的順反異構(gòu)（圖1）來表征脂肪酸。目前，常根據(jù)脂肪鏈飽和度，將脂肪酸分為飽和脂肪酸（SFA）和不飽和脂肪酸（UFA）。據(jù)文獻報道，哺乳動物體內(nèi)脂肪酸多為直鏈脂肪酸，支鏈脂肪酸主要來源于微生物，且多為SFA。UFA的結(jié)構(gòu)多樣主要與脂肪碳鏈的長短、雙鍵數(shù)目與位置，以及雙鍵的順反異構(gòu)相關(guān)。UFA又可分為單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）。盡管MUFA只含一個碳碳雙鍵，但由于碳碳雙鍵在長脂肪鏈中位置不同或存在順反異構(gòu)，相同相對分子質(zhì)量的MUFA也具有一系列異構(gòu)體，如巖芹酸與油酸。隨著雙鍵數(shù)目的增加，異構(gòu)體也相應增加，PUFA結(jié)構(gòu)多樣性更為突出。由于UFA結(jié)構(gòu)多樣，只反映其來源和特點的通俗命名往往無法對這類化合物進行系統(tǒng)區(qū)分。為了解決這一問題，脂質(zhì)代謝物數(shù)據(jù)庫LIPID MAPS根據(jù)碳原子數(shù)目、碳碳雙鍵個數(shù)和位置等對UFA命名做了系統(tǒng)歸納，如命名為FA 18∶1 (9Z) 的UFA中FA代表脂肪酸，18代表脂肪酸中碳原子數(shù)目，1代表雙鍵數(shù)目，括號中9代表從羧基碳開始計數(shù)的雙鍵所在位置，Z為順式構(gòu)型（E為反式構(gòu)型）。
由于種類及結(jié)構(gòu)不同，UFA之間的生理功能差異巨大。即使同一種類、相同分子式的 UFA，其在生理和病理過程中的作用也有可能存在明顯不同。如，α-亞麻酸和γ-亞麻酸因一個雙鍵在脂肪鏈中位置的不同而互為異構(gòu)體。γ-亞麻酸在改善自閉癥方面效果顯著，而α-亞麻酸可降低心臟性猝死風險。研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)生理過程形成的UFA表現(xiàn)為順式構(gòu)型，而 UFA 反式構(gòu)型主要通過食物（主要是加工食物）攝入。工業(yè)形成的反式UFA 攝入過多會增加心血管疾病、動脈粥樣硬化和糖尿病的發(fā)生，且容易引起肥胖。因此，結(jié)構(gòu)鑒定和精細解析各類UFA，尤其是異構(gòu)體，對于探究UFA生理病理作用機制顯得尤為必要。
由于UFA官能團少、體內(nèi)濃度水平低、異構(gòu)體眾多，對樣本中各類UFA的結(jié)構(gòu)表征仍面臨諸多挑戰(zhàn)。目前，質(zhì)譜（MS）檢測技術(shù)選擇性好、靈敏度高，并可提供化合物質(zhì)量信息和結(jié)構(gòu)信息等，開發(fā)各種質(zhì)譜分析方法成為解決UFA檢測難題的一種有效途徑。近年來，質(zhì)譜技術(shù)在UFA檢測方面具有廣泛應用，各種質(zhì)譜表征方法不斷涌現(xiàn)。本工作圍繞UFA的結(jié)構(gòu)鑒定和精細解析，對所使用的質(zhì)譜分析方法進行綜述，以期為各領(lǐng)域的UFA研究提供有價值的參考。
1.UFA質(zhì)譜表征方法
研究人員從脂肪碳鏈解析、雙鍵位置解析和順反異構(gòu)解析等3個途徑綜述質(zhì)譜分析方法對UFA結(jié)構(gòu)的解析過程。
1.1 脂肪碳鏈解析
脂肪碳鏈的解析包括碳鏈長短和雙鍵數(shù)目的解析。由于直鏈UFA的結(jié)構(gòu)較為固定，可根據(jù)分子質(zhì)量信息推導UFA分子式并進一步確定UFA的脂肪鏈長短和不飽和度，常見UFA雙鍵數(shù)目不大于6個。目前，采用質(zhì)譜技術(shù)直接檢測UFA來獲取分子質(zhì)量信息已有較多應用，如對血漿、干血斑、植物油、葡萄果皮和種子等樣品中 UFA的測定。
用于UFA檢測的各類質(zhì)譜技術(shù)，如色譜 [ 氣相色譜（GC）或液相色譜（LC）]- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS或LC-MS）、離子淌度（IM）質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（IM-MS）、原位電離質(zhì)譜技術(shù)等，具有高靈敏度、高選擇性等諸多優(yōu)點，但直接用于UFA檢測時仍面臨諸多問題。如采用GC-MS直接檢測時，由于UFA揮發(fā)性差，其檢測靈敏度低；采用LC-MS直接檢測時，由于脂肪碳鏈長及官能團少，UFA 離子化效率較低；采用原位電離質(zhì)譜技術(shù)直接檢測時，生物樣本基質(zhì)干擾非常嚴重。為提高UFA檢測靈敏度，進而獲取復雜生物體系中微量或痕量UFA的分子質(zhì)量信息，目前多采用衍生化-質(zhì)譜法進行 UFA的測定。
衍生化-質(zhì)譜法可明顯提高UFA的檢測靈敏度和選擇性，但由于各類UFA物理化學性質(zhì)差異巨大以及各類質(zhì)譜技術(shù)適用范圍不同，采用單一衍生化方法難以實現(xiàn)所有UFA的最優(yōu)檢測。因此，應根據(jù)所用技術(shù)、研究目的、研究對象，選擇合適 的衍生化方法。例如，采用GC-MS分析UFA時，常用的衍生化方法有甲酯化、乙酯化、硅烷化和酰胺化，其衍生化目的主要是降低UFA的極性和提高UFA的揮發(fā) 性；采用LC-MS分析UFA時，衍生化試劑設計原理為在UFA分子中引入含N、O 等的質(zhì)子親合能較好的基團，從而提高離子化效率；采用原位電離質(zhì)譜技術(shù)分析時，為降低基質(zhì)效應，也會將UFA衍生化，衍生化試劑有2-氨甲基吡啶、N，N- 二甲基哌嗪碘化物等。考慮到關(guān)于脂肪酸衍生化的研究已有較多綜 述，研究人員僅對2013— 2022年開發(fā)的UFA衍生化試劑進行了簡單介紹，具體見表1。其中，ESI為電噴霧電離，MS/MS為串聯(lián)質(zhì)譜，MALDI為基質(zhì)輔助激光解吸電離，MSI為質(zhì)譜成像。
1.2 雙鍵位置解析
在獲取分子質(zhì)量信息后，可進一步通過判斷雙鍵位置實現(xiàn)位置異構(gòu)體的鑒定，該步驟是解析UFA長期存在的一種挑戰(zhàn)。究其原因為質(zhì)譜表征技術(shù)的碰撞誘導解離（CID）或高能碰撞解離不足以破壞碳碳雙鍵結(jié)構(gòu)進而產(chǎn)生特征碎片信息。目前常采用衍生化-質(zhì)譜法實現(xiàn)UFA雙鍵位點或羧基的衍生化，并根據(jù)衍生化產(chǎn)物的碎裂圖譜獲取有關(guān)雙鍵位置的信息。解析 UFA雙鍵位置常用的衍生化反應有Paternò-Büchi（P-B）反應、環(huán)氧化反應、臭氧化-分解反應、電荷遠程裂解（CRF）等。
1.2.1 P-B反應
2014 年，MA等將醛和烯烴之間的光化學環(huán)加成反應應用到不飽和脂質(zhì)的雙鍵位置解析中，實現(xiàn)了丙酮與不飽和脂質(zhì)之間的光化學反應，對反應產(chǎn)物進行質(zhì)譜分析，可以獲取雙鍵位置相關(guān)信息。具體操作如下：配制含10μmol·L−1油酸的50%（體積分數(shù)）丙酮溶液，并向其中加入含 1%（質(zhì)量分數(shù)）氫氧化銨的溶液。將上述溶液引入納升電噴霧離子源（nanoESI）中霧化，油酸分子與丙酮分子在光照下發(fā)生在線P-B反應，反應產(chǎn)物進入質(zhì)譜并經(jīng)CID得到碎裂譜圖，根據(jù)圖譜中特征離子質(zhì)荷比（m/z）197.2，171.1來推導油酸中雙鍵位置。之后，MA等進一步將該反應用于鼠腦和乳腺癌組織，以及人前列腺癌細胞中UFA的定量分析。XIE等將該反應和IM-MS聯(lián)用，用于共軛脂肪酸異構(gòu)體如共軛亞油酸 FA18∶2（9Z，11E）和FA 18∶2（10E，12Z）的區(qū)分。此外，TANG等[55] 將P-B反應與MS/MS技術(shù)相結(jié)合開發(fā)了常壓質(zhì)譜技術(shù)，即微液節(jié)點表面采樣探針/P-B反應/ESI-MS分析技術(shù)。該技術(shù)首次實現(xiàn)了組織樣本中不飽和脂質(zhì)位置異構(gòu)體的原位分析，并用于鼠腦、肝、脾、肺、腎等多種組織中不飽和脂質(zhì)位置異構(gòu)體的快速篩查和相對定量。在此基礎上，CHONG等將P-B反應與MS/MS技術(shù)相結(jié)合研究多發(fā)性硬化癥小鼠模型中的UFA，并鑒定出一系列UFA及其位置異構(gòu)體，如FA17∶1（10Z）、FA18∶1 （9Z）、FA18∶1（11Z）、FA18∶2（9Z，12Z）、FA 20∶4 （5Z，8Z，11Z，14Z）等，發(fā)現(xiàn)患有自身免疫性腦脊髓炎的試驗小鼠（患病小鼠）和健康小鼠的脊髓中脂肪酸存在顯著差異。考慮到肼苯噠嗪是一種已被證實的丙烯醛（鼠脊髓挫傷后其在體內(nèi)濃度水平會顯著升高，是脂質(zhì)過氧化的一種反應產(chǎn)物）清除劑，該工作還探究了肼苯噠嗪治療前后小鼠體內(nèi)脂肪酸的變化，結(jié)果顯示加入肼苯噠嗪后，患病小鼠脊髓中FA18∶1 （11Z）與FA18∶1（9Z）的比例明顯增高。
盡管P-B反應可實現(xiàn)雙鍵位置的推導，但負離子模式下UFA的離子化效率較低。ESCH等將P-B反應中使用的丙酮換為乙酰吡啶，實現(xiàn)了正離子模式下的檢測，在提高UFA離子化效率的同時還能確定碳碳雙鍵的位置。XU等先對UFA進行 P-B反應，再將UFA上羧基用N，N-二乙基-1，2- 乙二胺進行酰胺化，并對所得反應產(chǎn)物進行ESI-MS/MS分析，最終實現(xiàn)了含1~6個雙鍵的UFA的精確結(jié)構(gòu)判斷。DENG等采用苯甲酮作為P-B反應的衍生化試劑，并將該反應與開發(fā)的表面修飾探針納升電噴霧質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用進行樣品測定。該聯(lián)用技術(shù)不僅擴大了P-B反應應用范圍、提高了衍生化效率、增加了衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜分辨率（由于苯甲酮的相對分子質(zhì)量較大，它與UFA的反應產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量亦明顯增大，產(chǎn)物離子和碎片離子更容易被識別），還實現(xiàn)了活體樣本中脂類的原位檢測。
P-B反應具有快速，反應產(chǎn)物碎裂時 CID能量低等優(yōu)點，可實現(xiàn)樣品的原位分析，在UFA雙鍵位置解析中占據(jù)一席之地。利用P-B反應分析PUFA，可產(chǎn)生多個加合離子，其中單分子衍生化試劑與PUFA中任一雙鍵反應所得加合離子強度最高，這些單一加合離子經(jīng)CID裂解可獲取PUFA中對應雙鍵信息。然而，隨著 PUFA 長脂肪鏈中雙鍵數(shù)的增多（如雙鍵數(shù)大于 4），非P-B反應產(chǎn)物離子豐度隨之增加，難以獲取雙鍵相關(guān)信息。為增加 P-B反應在PUFA中的適用性，可將P-B反應產(chǎn)物與Li+加合形成 [M+Li]+后再進行 CID裂解，或采用同位素標記方法識別碎裂圖譜中的同位素特征離子。
1.2.2 環(huán)氧化反應
環(huán)氧化反應是指含碳碳雙鍵的化合物在環(huán)氧化試劑作用下生成環(huán)氧化物的反應。由于結(jié)構(gòu)中存在雙鍵，UFA的環(huán)氧化比較容易發(fā)生。2017年，ZHAO等首次將環(huán)氧化反應與MS/MS相結(jié)合應用于UFA 分析中，并根據(jù)碎裂圖譜中特征離子信息推導出雙鍵位置。具體試驗流程如下：將 UFA溶于含1%（體積分數(shù)）氨水的50%丙酮溶液中，分取0.1mL置于1.5mL離心管中，在離心管中吹入低溫等離子體（LTP），以促進過氧化酮產(chǎn)生；產(chǎn)生的過氧化酮與 UFA 發(fā)生環(huán)氧化反應，將反應產(chǎn)物引入nanoESI源中離子化，繼而進入MS/MS進行分析；根據(jù)圖譜中分子信息和特征碎片信息實現(xiàn)UFA的鑒定。2018年，ZHAO等對上述檢測裝置做了改進，將UFA溶液滴于紙帶上，并將紙帶放置在LTP探針和質(zhì)譜進樣口之間，UFA的環(huán)氧化和離子化瞬時發(fā)生，5s即可完成整個分析流程。CHINTALAPUDI等開發(fā)了集成電催化nanoESI的平臺，檢測原理如下：在電噴霧離子化過程中，直流電壓使電極表面形成氧化物，電極氧化物與 UFA 碳碳雙鍵發(fā)生原位環(huán)氧化反應，所得各離子用MS/MS分析，從而獲取分子信息和特征碎片信息。SWINER等開發(fā)了線噴霧離子化方法，即通過在纖維線上施加直流高電壓產(chǎn)生電暈放電，使UFA在極性溶劑噴霧中發(fā)生雙鍵的環(huán)氧化，進而進行MS/MS分析，方法成功運用于肥胖病人血清中脂肪酸的鑒定。除了上述試劑，間氯過氧苯甲酸、單過硫酸氫鉀等環(huán)氧化試劑也可用于UFA雙鍵位置的解析。
對于PUFA，環(huán)氧化反應不止發(fā)生在單一雙鍵上，會出現(xiàn)多個雙鍵的同時環(huán)氧化。當PUFA分子上有兩個及以上雙鍵被氧化時，其碎裂圖譜十分復雜，難以解析，且雙鍵數(shù)目越多，衍生化反應越復雜，所得質(zhì)譜圖亦越復雜，特征碎片越難以識別。目前采用環(huán)氧化方法分析PUFA 時，常用PUFA中單一雙鍵發(fā)生環(huán)氧化的產(chǎn)物作為分析目標物，通過各目標物特征碎片的識別來推導PUFA中各雙鍵的位置。此外，常用環(huán)氧化衍生化試劑的使用、存儲安全性問題也不可忽略。
1.2.3 臭氧化-分解反應
臭氧化-分解反應簡稱臭氧解反應，其反應過程如下：雙鍵首先被臭氧氧化成環(huán)氧化合物，環(huán)氧化合物再水解成羰基化合物。2005 年，THOMAS等將臭氧解反應與ESI-MS相結(jié)合，用于磷脂雙鍵位置的解析。該研究采用氧氣作為霧化氣，當 ESI噴針產(chǎn)生電暈放電時氧氣會反應形成臭氧等離子體，該等離子體會與雙鍵相互作用產(chǎn)生羰基化合物，以此可判斷雙鍵位置。該研究團隊還開發(fā)了臭氧電噴霧電離質(zhì)譜（OzESI-MS）和臭氧誘導解離（OzID）技術(shù)，進一步提高了臭氧解反應效率，且正負離子模式下均可實現(xiàn)檢測，為分析復雜樣本中的UFA提供了可能，但也對質(zhì)譜改裝提出了更高的要求。隨后，臭氧解與質(zhì)譜聯(lián)用裝置的研究越來越多。2011年，ZHANG等利用LTP探針在離子源內(nèi)制造臭氧，臭氧與UFA發(fā)生反應生成臭氧解衍生化產(chǎn)物離子，對該離子進行質(zhì)譜分析，可以確定UFA雙鍵位置。上述研究所用裝置對質(zhì)譜儀類型無要求，且無需進行儀器改裝即可實現(xiàn)樣品的原位分析，但對復雜樣本中脂質(zhì)的分析具有一定局限性。HARRIS等和STINSON等利用低壓汞燈發(fā)出的185nm紫外光照射溶液使其中氧氣反應產(chǎn)生臭氧，臭氧再與 UFA發(fā)生環(huán)化解離等反應，所用裝置簡單、低耗、質(zhì)譜兼容性好。KOKTAVÁ等 將金屬氧化物激光離子化質(zhì)譜成像技術(shù)與臭氧解相結(jié)合，在脂肪酸質(zhì)譜成像的基礎上，實現(xiàn)了UFA雙鍵位置異構(gòu)這種更深層次結(jié)構(gòu)的區(qū)分和成像。此外，臭氧解與其他原位質(zhì)譜技術(shù)如實時直接分析質(zhì)譜技術(shù)等的結(jié)合，也可用于UFA的檢測。
臭氧解還可與衍生化反應聯(lián)用來測定 UFA。POAD等將N（-4-氨基甲基苯基）吡啶鎓（AMPP）衍生化與OzID技術(shù)相結(jié)合用于UFA的測定。其中，AMPP衍生化增強了UFA離子化效率，且利用衍生化產(chǎn)物CID所得部分衍生化離子的母離子掃描可實現(xiàn)UFA脂肪鏈長短和不飽和度解析；使衍生化產(chǎn)物再發(fā)生臭氧解反應，可實現(xiàn)雙鍵位置的清晰判斷。這兩種技術(shù)相結(jié)合的方法已被用于胎兒皮脂分泌物中UFA的測定，鑒定出了若干新UFA位置異構(gòu)體，揭示了樣本中脂肪酸的異構(gòu)多樣性。
臭氧解反應應用廣泛，是一種簡單、快速的氧化反應。與環(huán)氧化反應、P-B反應不同的是，分析臭氧解產(chǎn)物時無需碰撞裂解即可實現(xiàn)雙鍵位置的解析，即采用一級質(zhì)譜即可完成雙鍵位置的判斷。但臭氧解產(chǎn)物不如其他衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定，故該方法對分析條件要求較為苛刻，常需要改裝離子源或質(zhì)譜儀以滿足在線反應的發(fā)生。此外，相比于其他衍生化反應，采用臭氧解反應解析UFA雙鍵位置時，特征離子強度相對較低。
1.2.4 電荷遠程裂解
一般來說，采用質(zhì)譜直接分析UFA很難得到與雙鍵位置相關(guān)的特征離子信息。如采用電子轟擊電離源分析UFA時會出現(xiàn)大量重排和裂解離子，采用化學電離源分析UFA時缺少碎裂離子。TOMER等發(fā)現(xiàn) UFA 負離子[M−H] −經(jīng)碰撞激活解離后，可在雙鍵左右兩邊烯丙基位斷裂處產(chǎn)生與雙鍵位置相關(guān)的特征離子。HSU等采用多級線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)對UFA的金屬加合離子 [M−H+2Li]+進行分析，根據(jù)二級圖譜中特征離子確定了雙鍵位置，并詳細闡明了 [M−H+2Li]+的質(zhì)譜裂解規(guī)律，如 MUFA 主要發(fā)生麥氏（McLafferty）重排，PUFA主要發(fā)生雙鍵乙烯基或烯丙基位裂解。YOO等采用電子誘導解離（EID）碎裂 UFA 金屬加合離子 [M+Mn −H]+，發(fā)現(xiàn)雙鍵處斷裂所得碎片離子峰強度明顯較低，根據(jù)該特征可以判斷所有雙鍵的位置。但由于采用EID碎裂，除電荷遠程裂解外，還存在其他裂解方式，碎裂圖譜信息較為復雜，且離子信號較低。RANDOLPH等采用低能CID方式將三- 鄰二氮雜菲堿土金屬絡合物與UFA負離子 [M−H]−發(fā)生離子交換形成的 [M−H+Cat]+（Cat=Mg2+、Ca2+、Sr2+ 或Ba2+）碎裂，得到了可以反映雙鍵位置的特征離子。該方式提升了反應的可控性以及譜圖的重現(xiàn)性，有利于雙鍵位置的判斷。
2013年，WANG等采用AMPP、N-（苯甲胺）-2，4，6- 三甲基吡啶鎓（BMA-TMP）、N（-4- 氨基甲基芐基）-2，4，6-三甲基吡啶鎓和4-氨基甲基-1-甲基吡啶-1-鎓（AMMP）等衍生化試劑對脂肪酸進行酰胺化來考察電荷環(huán)境對遠程裂解的影響。探究發(fā)現(xiàn)，整個電荷體系為共軛體系，而非體系中電荷所處位置，與羰基之間的距離對電荷遠程裂解方式影響極大。上述研究結(jié)果說明，AMPP、BMA-TMP、AMMP衍生化產(chǎn)物離子的脂肪鏈具有大致相同的裂解方式，該裂解方式可產(chǎn)生與雙鍵位置相關(guān)的碎片離子。YANG等采用AMPP對UFA進行衍生化，并根據(jù)衍生化產(chǎn)物碎裂圖譜中近雙鍵位置離子強度的下降確定雙鍵位置，以及根據(jù)相差40Th的系列碎片離子確定多個雙鍵位置的存在。之后，其將該方法用于人血清中UFA的篩查和量化，成功檢測出α-亞麻酸和γ-亞麻酸，并證明中性酯中γ-亞麻酸和α-亞麻酸的比率比二者非酯化的比率高出3倍。FRANKFATER等實現(xiàn)了AMPP衍生化與原位質(zhì)譜的聯(lián)用，并評價了基質(zhì)輔助激光解吸電離-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜在脂肪酸結(jié)構(gòu)鑒定方面的應用。此外，將脂肪酸甲酯（FAME）轉(zhuǎn)化為二甲基惡唑啉（DMOX）衍生物，然后進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，也可以得到用于雙鍵位置判斷的碎片離子。
由于脂肪鏈斷裂時存在大量非選擇性斷裂，UFA電荷遠程裂解所得碎裂圖譜較為復雜且特征離子信噪比低，不易于判斷化合物碳碳雙鍵的位置。此外，與P-B反應、環(huán)氧化反應、臭氧解反應相比，電荷遠程裂解對形成的母離子有一定要求，采用該裂解方式難以實現(xiàn)樣品的原位分析。
1.2.5 其他方法
THOMAS等通過以下兩種方式獲取 UFA的 [M−2H+Na] −離子：①將含氟化鈉和UFA的甲醇溶液引入ESI源，在負離子模式下得到 [M−H+NaF] −，之后對 [M −H+NaF] −進行CID裂解獲取；②將含氫氧化鈉或碳酸氫鈉以及UFA的甲醇溶液引入ESI源，在負離子模式下直接獲取。獲得的 [M−2H+Na] −離子是由羧基和脂肪鏈雙烯丙基位均失去質(zhì)子而形成的穩(wěn)定共軛負離子。在CID條件下，該共軛負離子的雙鍵及其鄰位或烯丙基位會經(jīng)電荷導向裂解過程產(chǎn)生與雙鍵位置相關(guān)的特征離子。由于MUFA形成的 [M−2H+Na]−強度低，以及含兩個雙鍵的UFA反應所得 [M −2H+Na] −的碎裂特異性差，本方法不適用于含有一個或兩個雙鍵的UFA位置異構(gòu)體的確定，僅適用于含有不小于3個雙鍵的UFA位置異構(gòu)體的確定。
由于UFA中雙鍵可吸收特定波長紫外光，導致電子被高能激發(fā)而發(fā)生UFA直接碎裂或UFA分子內(nèi)能量重新分配后碎裂。目前已有多項研究采用紫外光解離質(zhì)譜技術(shù)分析UFA，該方法基于碳碳雙鍵對光子吸收的選擇性以及臨近碳碳雙鍵的位置易發(fā)生斷裂來獲得高強度的特征離子，從而實現(xiàn)UFA位置異構(gòu)體的區(qū)分。采用光敏衍生化試劑，如1-[3-（氨基甲基）-4- 碘苯基 ] 吡啶 -1- 鎓、1-[4-（氨基甲基）-3- 碘苯基 ] 吡啶-1-鎓、4-碘苯胺、N（-2- 氨基乙基）-4-碘苯甲酰胺等，結(jié)合光解離質(zhì)譜技術(shù)，可實現(xiàn)衍生化產(chǎn)物在離子源內(nèi)的自由基定向解離，進而根據(jù)所得特征離子來判斷雙鍵位置，并通過CID裂解獲取多級質(zhì)譜圖。其他可以解析雙鍵位置的衍生化-質(zhì)譜法還有很多，如ZHANG等以氯胺-T為衍生化試劑對UFA和磷脂酰膽堿的雙鍵進行衍生化，再通過CID碎裂獲取與雙鍵位置有關(guān)的特征碎片信息，并將該方法用于人甲狀腺癌組織中UFA的探究；利用高效液相色譜-大氣壓化學電離-串聯(lián)質(zhì)譜法分析FAME時，F(xiàn)AME中雙鍵可與乙腈形成加合離子 [M+C3H5N]+· ，經(jīng)質(zhì)譜分析后可獲取與雙鍵位置有關(guān)的特征碎片信息；以氧氣為衍生化試劑，與MUFA發(fā)生氧化反應獲取4種烯醇異構(gòu)體，再通過CID裂解獲取4種與雙鍵位置相關(guān)的碎片離子。
解析UFA雙鍵位置是目前的研究熱點之一，常用方法包括P-B反應、環(huán)氧化反應、臭氧解反應、電荷遠程裂解等，其他各類衍生化 - 質(zhì)譜法也在不斷涌現(xiàn)。這些質(zhì)譜表征方法在衍生化反應速率、裝置普
適性、原位分析的適用性、產(chǎn)物離子的質(zhì)譜響應和譜圖復雜性等方面各有不同（見表2），使用時需根據(jù)具體情況選擇合適方法。
1.3 順反異構(gòu)解析
很多UFA順反異構(gòu)體在生物體中表現(xiàn)出明顯不同的生理效應，其表征具有重要意義。在獲取分子質(zhì)量信息和雙鍵位置后，更深入地去判斷分子的順反異構(gòu)，會進一步增加UFA的解析難度。目前，常用衍生化-質(zhì)譜法或新開發(fā)的質(zhì)譜技術(shù)來區(qū)分UFA順反異構(gòu)體。
SCRIBE等對MUFA進行酯化獲得單不飽和脂肪酸甲酯（MUFAME）后，采用二甲基二硫醚（DMDS）與MUFAME中雙鍵發(fā)生加合反應，并對加合產(chǎn)物進行 GC-MS分析，原雙鍵位置發(fā)生斷裂，所得的質(zhì)譜圖中含有加合產(chǎn)物分子離子（M+）峰及與雙鍵位置相關(guān)的特征離子峰。另外，由于雙鍵順、反式結(jié)構(gòu)的不同，MUFAME會分別產(chǎn)生蘇式和赤式加合物，可在GC上實現(xiàn)很好地分離，因此該方法可用于精確區(qū)分 MUFA 順反異構(gòu)體，但是不適用于復雜樣品的分析。SHIBAMOTO等采用DMDS衍生亞油酸甲酯順反異構(gòu)體，所得加合物用GC-MS分析，用于區(qū)分亞油酸（一種二烯酸）順反異構(gòu)體。對于含有亞甲基間隔的雙 - 順式或雙-反式二烯酸來說，由于空間位阻的存在，DMDS加合反應只能發(fā)生在一個雙鍵上，并分別生成兩種加合物；對于含有亞甲基間隔的單-順式（單 - 反式）二烯酸，DMDS加合反應只發(fā)生在順式雙鍵上，生成一種加合物。因此，根據(jù)質(zhì)譜圖中M+峰、與雙鍵位置相關(guān)的特征離子峰以及色譜峰的個數(shù)和保留時間可以實現(xiàn)含亞甲基間隔雙鍵的二烯酸順反異構(gòu)體的判斷，但對于含有亞甲基間隔的單-順式（單-反式）二烯酸來說，該方法難以判斷其中反式雙鍵的位置。
UFA順反異構(gòu)體的質(zhì)譜裂解規(guī)律幾乎一致，無法根據(jù)碎片離子m/z進行區(qū)分，但圖譜中與雙鍵相關(guān)離子的信號強度會存在一定差異，可以此作為區(qū)分順反異構(gòu)體的依據(jù)。PHAM等采用4-碘苯胺（pIA）與FAME反應形成帶質(zhì)子絡合物（[FAME + pIA]+），經(jīng) CID碎裂后可獲得該絡合物的碎裂圖譜，根據(jù)碎裂圖譜中兩個特征離子的強度比可以區(qū)分雙鍵順反異構(gòu)體，如 [FAME 18∶1(9Z) + pIA]+碎裂圖譜中m/z297峰強度比 m/z 295峰的高，[FAME 18∶1(9E) + pIA]+碎裂圖譜中m/z 295峰強度比m/z 297峰的高。
離子-電子碰撞活化（EIEIO）質(zhì)譜技術(shù)可用于脂質(zhì)的分析。在用5~16eV的電子束照射單電荷脂質(zhì)離子后，根據(jù)譜圖中氫丟失非自由基產(chǎn)物離子（由臨近雙鍵的甲基端碳碳單鍵碎裂產(chǎn)生）強度的差異，可以判斷雙鍵的順反式，這是由于順式異構(gòu)體的臨近雙鍵的碳碳單鍵碎裂情況與其他單鍵碎裂情況接近，而反式異構(gòu)體碎裂產(chǎn)生的氫丟失非自由基產(chǎn)物離子強度較高。差分離子淌度（DMS）可以用來分離順反異構(gòu)體，因此 DMS-EIEIO MS 也是一種鑒定UFA順反異構(gòu)的可行性手段。
由于UFA順反異構(gòu)體的質(zhì)譜裂解規(guī)律幾乎一致，且UFA多數(shù)特征離子強度的差異并不明顯，因此質(zhì)譜表征技術(shù)鑒定 UFA 異構(gòu)體仍存在巨大挑戰(zhàn)。考慮到采用質(zhì)譜表征技術(shù)區(qū)分UFA順反異構(gòu)體的現(xiàn)有研究較少，且UFA順反異構(gòu)體表征對生命活動中多種生理功能具有深遠影響，質(zhì)譜表征技術(shù)的研究需要投入更多，而新的衍生化 - 質(zhì)譜方法或新的質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展或成為解析UFA順反異構(gòu)體的未來發(fā)展方向。
2.總結(jié)
UFA在生物體內(nèi)廣泛存在，不同結(jié)構(gòu)，甚至相同結(jié)構(gòu)、不同構(gòu)造或不同構(gòu)型的UFA的生理效應都可能存在巨大差異。因此，對UFA進行深入解析有利于發(fā)現(xiàn)生物標志物和闡釋疾病機制。研究人員從UFA的結(jié)構(gòu)鑒定和精細解析兩方面出發(fā)，對UFA質(zhì)譜表征方法進行了歸納總結(jié)，主要從脂肪碳鏈解析、雙鍵位置解析、順反異構(gòu)解析等3個途徑系統(tǒng)概括了UFA的深入解析過程，并指出了部分衍生化方法中的關(guān)鍵細節(jié)和優(yōu)缺點。雖然現(xiàn)有質(zhì)譜表征方法具有諸多優(yōu)勢，但其局限性也較為明顯，如P-B衍生化反應解析PUFA時副反應較多、環(huán)氧化反應解析PUFA時會出現(xiàn)多個雙鍵的同時環(huán)氧化、UFA臭氧解產(chǎn)物不穩(wěn)定、UFA電荷遠程裂解存在大量非選擇性斷裂等。此外，UFA順反異構(gòu)體解析目前仍存在巨大挑戰(zhàn)。這些存在的問題均對UFA的質(zhì)譜表征新方法提出更高要求：在提高檢測靈敏度的同時，還需滿足衍生化反應快速、高效、原位、生物兼容等要求，以實現(xiàn)各種基質(zhì)樣本的測試；衍生化產(chǎn)物更穩(wěn)定；所得譜圖干凈、重現(xiàn)性好，且可提供更深層次UFA解析信息；發(fā)展新式質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。質(zhì)譜表征方法的不斷推陳出新和對現(xiàn)有表征技術(shù)進行優(yōu)勢整合，可為UFA結(jié)構(gòu)表征新方法的開發(fā)指明方向。
作者：覃勇 1，2，王敏丹1，劉莉1，馮陳國1，陳秀萍1，2，張芳1，2
單位：1. 上海中醫(yī)藥大學 創(chuàng)新中藥研究院 手性藥物研究中心；
2. 廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所
來源：《理化檢驗-化學分冊》2024年第12期
來源：理化檢驗化學分冊
