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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-03-06 20:14
摘 要： 建立高效液相色譜法測定舒美寧膠囊中的4種大豆異黃酮成分，并綜合評價不同廠家、不同批號舒美寧膠囊的質(zhì)量。舒美寧膠囊樣品經(jīng)Thermo Hypersil-Keystone C18色譜柱分離，以乙腈-水溶液為流動相梯度洗脫，柱溫為40 ℃，檢測波長為254 nm。通過化學計量學、熵權優(yōu)劣解距離法對其大豆異黃酮成分差異性進行研究。大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素的質(zhì)量濃度分別在各自的線性范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.999 5。樣品平均回收率為97.57%~98.15%，測定結果的相對標準偏差為0.88%~1.47%（n=6）。化學計量學研究表明15批舒美寧膠囊聚類為3類，大豆苷、染料木苷是影響舒美寧膠囊質(zhì)量的特征性成分。該方法可用于舒美寧膠囊的質(zhì)量評價，并為其內(nèi)在質(zhì)量的有效控制提供了參考依據(jù)。
關鍵詞： 舒美寧膠囊； 高效液相色譜法； 化學計量學； 熵權優(yōu)劣解距離法； 質(zhì)量評價
舒美寧膠囊是一款以大豆異黃酮為主要成分的保健品，大豆異黃酮的分子結構與人體雌激素結構極為相似，它能夠調(diào)節(jié)生物體內(nèi)分泌和代謝紊亂等問題，因此舒美寧膠囊特別適宜睡眠不佳的成年女性改善睡眠[1-3]。
目前舒美寧膠囊的含量檢測報道較少[4]，測定大豆異黃酮含量的報道較多，檢測方法主要包括薄層掃描法[5-6]、紫外分光光度法[7-8]、高效液相色譜法[9-12]、超高效液相色譜法[13-14]等。其中，薄層掃描法具有操作簡便、快速且成本低的優(yōu)點，但其精密度和準確性相對較低；紫外分光光度法雖然設備簡單、操作方便且靈敏度高，但其準確性仍有待提高；超高效液相色譜法盡管分析效率高，但成本較高，且設備普及率不如高效液相色譜法。相比之下，高效液相色譜法以其高分離性能、快速分析、定量準確、操作簡便及設備普及率高等優(yōu)勢，成為大豆異黃酮定量分析中最廣泛應用的方法。
化學計量學是數(shù)學、統(tǒng)計學、計算機科學與化學結合而形成的化學分支學科，它能科學處理和解析數(shù)據(jù)并從中提取有用信息，更全面地評價產(chǎn)品品質(zhì)。借助化學計量學中的層次聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)、正交偏小二乘法-判別分析(OPLS-DA)等方法[15-18]，可以對多批次樣品間各評價指標數(shù)據(jù)差異進行分析，查找對產(chǎn)品品質(zhì)起決定性作用的主要潛在質(zhì)量標志物。化學計量學因結果準確度高而廣泛應用于評價中藥材、中成藥等成分復雜物質(zhì)的質(zhì)量。熵權優(yōu)劣解距離[19](EW-TOPSIS)法通過對各評價指標的相關數(shù)據(jù)進行歸一化處理、加權決策矩陣分析，計算最優(yōu)、最劣距離以及各評價指標與最優(yōu)方案的接近程度，反映各評價指標間的差距，從而對樣品的品質(zhì)差異進行科學評價，具有較好的準確性和科學性。高效液相色譜多成分定量聯(lián)合化學計量學和熵權優(yōu)劣解距離法評價舒美寧膠囊質(zhì)量的方法，尚未見報道。
筆者采用高效液相色譜法對舒美寧膠囊多種大豆異黃酮進行定量測定，并結合化學計量學及熵權優(yōu)劣解距離法對舒美寧膠囊進行質(zhì)量評價，不僅有助于舒美寧膠囊生產(chǎn)企業(yè)查找原因，完善產(chǎn)品質(zhì)量控制方法，還將控制全面、評價合理的多成分質(zhì)量控制方法引入保健品的質(zhì)量評價中，為提高我國保健品質(zhì)量提供了新的思路和參考。
1. 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：Waters2695型，配置Waters 2996-二極管陣列檢測器，美國沃特世公司。
電子天平：(1)AB-104N型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多有限公司；(2)AUW-220D型，感量為0.01 mg，日本島津儀器有限公司。
4種大豆異黃酮標準物質(zhì)信息見表1。
表1 4種大豆異黃酮標準物質(zhì)信息
Tab. 1 Information of 4 Soy isoflavones reference materials
乙腈：色譜純，純度(質(zhì)量分數(shù))不小于99.5%，北京迪科馬科技有限公司。
乙醇：分析純，純度(質(zhì)量分數(shù))不小于98.3%，天津市津東天正精細化學試劑廠。
舒美寧膠囊：本草天工牌舒美寧膠囊、知御堂中天駿康牌舒美寧膠囊、北京同仁堂舒美寧膠囊(樣品代號為S1～S15)。
實驗用水為濾過超級純凈水。
1.2 色譜條件
色譜柱：Thermo Hypersil-Keystone C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國賽默飛世爾科技公司)；柱溫：40 ℃；檢測波長：254 nm；進樣體積：10 μL；流動相：A相為乙腈，B相為水，洗脫方式：梯度洗脫，流量為1.0 mL/min：洗脫程序見表2。
表2 梯度洗脫程序
Tab. 2 Gradient elution procedure
1.3 溶液制備
混合對照品溶液：取減壓干燥至恒重的大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素對照品適量，精密稱定，將4種對照品分別置于10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶解并稀釋至標線，搖勻，作為對照品儲備液。量取4種對照品儲備液適量，精密量取，置同一50 mL容量瓶中，加入50%乙醇稀釋至標線，搖勻，即得混合對照品溶液。混合對照品溶液中，大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素的質(zhì)量濃度分別為42.8、40.3、38.5、45.8 μg/mL。
樣品溶液：取舒美寧膠囊內(nèi)容物0.1 g，精密稱定，置于50 mL容量瓶中。加入50%乙醇約40 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫。再加入50%乙醇定容至標線，搖勻后取上清液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過。
陰性樣品溶液：按舒美寧膠囊處方比例和生產(chǎn)工藝制備陰性樣品，按樣品溶液的方法制備。
系列混合標準工作溶液：分別精密吸取混合對照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，用50%乙醇溶解稀釋至10 mL，制成6種不同濃度的系列混合標準工作溶液。
1.4 實驗方法
建立HPLC法測定舒美寧膠囊多個大豆異黃酮的分析圖譜，利用標準曲線外標法進行定量分析，再運用化學計量學中的HCA、PCA、OPLS-DA以及EW-TOPSIS等方法對多批次舒美寧膠囊大豆異黃酮含量差異性進行分析。
2. 結果與討論
2.1 樣品制備方法優(yōu)化
2.1.1 提取溶劑考察
為選擇對測定的大豆異黃酮均有良好溶解能力的溶劑，考察了一系列不同比例的乙醇水溶液的提取效率。不同比例的乙醇水溶液對4種大豆異黃酮的提取效率如圖1所示。
圖1 不同提取溶劑提取效率圖
Fig. 1 Extraction efficiency chart of different extraction solvents
從圖1中可以看出，50%乙醇溶液對4種大豆異黃酮成分均有良好的提取效率，進一步增加或減少乙醇比例也不能提高提取效率。因此選擇50%乙醇溶液作為舒美寧膠囊的提取溶劑。
2.1.2 提取方式的選擇
大豆異黃酮的提取方式多樣，如溶劑浸提法、超聲波提取法、超臨界流體萃取法等，溶劑浸提法能有效進入大豆的細胞壁提取大豆異黃酮，但試劑消耗量大、提取時間長、提取效率低，超臨界流體萃取法由于設備要求較高、耗能大、成本昂貴，不適宜推廣使用，超聲波提取法與前兩者相比，不僅減少了有機試劑消耗量，同時還降低提取時間，提高了提取效率，提取時間10 min即可以獲得較高提取效率。從舒美寧膠囊的制備工藝可知，主要原料均已磨成粉末，其細胞壁已破壞，因此采用超聲提取，即可提取大豆異黃酮，故選擇超聲波提取為舒美寧膠囊的提取方法。
2.1.3 超聲時間考察
用舒美寧膠囊制備樣品溶液，比較超聲15、30、45、60 min各成分的提取效率。結果表明，超聲30 min已基本能將舒美寧膠囊中的大豆異黃酮有效提取，因此超聲時間選擇30 min。
2.2 方法專屬性
分別精密吸取混合對照品溶液、樣品溶液及陰性樣品溶液，在1.2儀器工作條件下進樣測定，色譜圖如圖2所示。從圖2中可以看出，舒美寧膠囊樣品中各成分與對照品在相應的保留時間處具有相同的色譜峰，且陰性樣品無干擾，表明該方法專屬性良好。
圖2 混合對照溶液、樣品溶液、陰性樣品溶液色譜圖
Fig. 2 Chromatograms of mixed standard solution， sample solution， and negative control solution
1—大豆苷；2—染料木苷；3—大豆苷元；4—染料木素
2.3 線性關系、檢出限及定量限
取系列混合標準工作溶液，在1.2色譜條件下進樣檢測，并記錄色譜圖。以色譜峰面積為縱坐標(y)，以混合對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線，計算線性方程。分別將系列混合標準工作溶液注入色譜儀進行檢測，以信噪比為3對應的質(zhì)量濃度作為檢出限，信噪比為10對應的質(zhì)量濃度作為定量限。4種大豆異黃酮成分的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限見表3。由表3可知，大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素的質(zhì)量濃度分別在各自的線性范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.999 5。
表3 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限
Tab. 3 Linear equations, linear ranges, and correlation coefficient values for each component
2.4 加標回收與精密度試驗
取同一批次舒美寧膠囊內(nèi)容物6份，每份約0.1 g，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，按樣品中4種大豆異黃酮含量的1∶1比例加入4種大豆異黃酮對照品溶液，再加入50%乙醇定容至標線，超聲處理30 min，放冷至室溫。再加入50%乙醇定容至標線，搖勻后取上清液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過。在1.2色譜條件下進樣測定，加標回收率試驗結果見表4。
表4 加標回收與精密度試驗結果
Tab. 4 Results of standard addition recoveries and precision test
由表4可知，樣品的平均回收率為97.57%～98.15%，測定結果的相對標準偏差為0.88%～1.47%（n=6），表明該方法準確度較高。
2.5 含量測定
取15批舒美寧膠囊，制備供試品溶液，在色譜儀中進樣測定，按照外標法計算大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素含量，舒美寧膠囊各成分含量結果見表5。
表5 舒美寧膠囊各成分含量
Tab. 5 The content of each component in Shumeining capsules
2.6 化學計量學的評價方法建立
2.6.1 層次聚類分析(HCA)
運用SPSS26.0統(tǒng)計軟件對15批樣品的4種大豆異黃酮含量數(shù)據(jù)進行層次聚類分析，并得到了相應的層次聚類分析圖，如圖3所示。通過層次聚類分析的結果，當選擇歐氏間距等于10作為分類標準時，15批舒美寧膠囊樣品可以清晰地劃分為三個類別，第1類是S10、S11、S1、S2、S3、S9，第2類是S13、S14、S15、S12，第3類是S4、S5、S6、S7、S8，這表明不同廠家生產(chǎn)的舒美寧膠囊大豆異黃酮的含量呈現(xiàn)一定的差異。
圖3 層次聚類分析圖
Fig. 3 Hierarchical clustering analysis chart
2.6.2 主成分分析(PCA)
將15批樣品的4種大豆異黃酮含量數(shù)據(jù)導入SPSS26.0統(tǒng)計軟件，舒美寧膠囊主成分方差分析結果見表6。
表6 舒美寧膠囊主成分方差分析結果
Tab. 6 Principal component analysis of variance results of shumeining capsules
由表6可知，舒美寧膠囊檢測結果中兩個初始特征值分別為1.895、1.042，均大于1.0，它們的方差百分比分別為47.37%、26.06%，累積方差比為73.43%，兩者合起來能體現(xiàn)舒美寧膠囊中大豆異黃酮73.43%的顯示表征。利用SIMCA14.1建立PCA模型，運用PCA模型得到了15批舒美寧膠囊樣品的主成分分析得分圖，如圖4所示。
圖4 舒美寧膠囊的主成分分析圖
Fig. 4 Principal component analysis of shumeining capsules
該模型提取了2個主成分，R2X為0.735,，大于0.5，表明建立的PCA模型具有較高的穩(wěn)定性。
2.6.3 正交偏小二乘法-判別分析(OPLS-DA)
為查明對產(chǎn)品質(zhì)量影響較大的大豆異黃酮成分，將15批樣品的4種大豆異黃酮含量數(shù)據(jù)導入SIMCA14.1軟件，利用OPLS-DA分析進行處理，舒美寧膠囊的OPLS-DA模型圖如圖5所示。從圖5中可以看出，區(qū)分參數(shù)R2Y為0.842，預測參數(shù)Q2為0.770，這些數(shù)值均表明所建立的模型是高效且穩(wěn)定的[18]。
圖5 舒美寧膠囊的OPLS-DA模型圖
Fig. 5 OPLS-DA model diagram of Shumeining capsules
對所建立的OPLS-DA模型中2個主成分進行交叉驗證(n=200)，OPLS-DA置換檢測結果如圖6所示。從圖6中可以看出，R2 擬合直線在Y軸截距為0.098，小于0.3，表明所建立的模型結果可靠。Q2擬合直線與Y軸交點為-0.563，小于0，表明所構建的OPLS-DA模型未過度擬合，具備良好的預測能力，可有效判別舒美寧膠囊中大豆異黃酮的質(zhì)量差異。
圖6 OPLS-DA置換檢測結果
Fig. 6 OPLS-DA permutation test results
進一步測定樣品的VIP值，并采用VIP值來確定不同批次樣品間的差異成分，結果如圖7所示。結果表明VIP值從大到小依次為染料木苷、大豆苷、染料木素和大豆苷元，其中染料木苷的VIP值為1.286、大豆苷的VIP值為1.162，均大于1.0，這2個成分對舒美寧膠囊中大豆異黃酮質(zhì)量差異具有較大影響，在舒美寧膠囊產(chǎn)品質(zhì)量控制中起著關鍵作用，可視為主要的潛在質(zhì)量標志物。
圖7 OPLS-DA中各成分VIP圖
Fig. 7 VIP plot of each component in OPLS-DA
2.7 熵權優(yōu)劣解距離法分析(EW-TOPSIS)
舒美寧膠囊中4種大豆異黃酮成分屬于最大最優(yōu)型指標，對15批舒舒美寧膠囊樣品中的4種成分數(shù)據(jù)進行歸一化處理，結果見表7，將OPLS-DA分析結果中的VIP值作為各指標成分的權重，并得出加權決策矩陣表，結果見表8。按照加權決策矩陣得出最優(yōu)方案Z+為1.286，最劣方案Z-均為0；，按照式(1)、式(2)、式(3)計算最優(yōu)、最劣距離(Di+、Di-)以及各評價指標與最優(yōu)方案的接近程度(Ci)，結果見表9。15批樣品中得分排名前三的依次為S9、S3、S10。
表7 不同樣品各成分歸一化處理結果
Tab. 7 Normalization results of different samples and components
表8 不同樣品各成分加權決策矩陣表
Tab. 8 Weighted decision matrix for different components of samples
(1)
(2)
(3)
式中：Zij——經(jīng)加權的標準化指標值；
Zj+——各評價指標的正理想解；
Zj-——各評價指標的負理想解；
Di-——各評價因素與負理想解的距離；
Di+——各評價因素與正理想解的距離；
Ci——第i個因素的相近程度。
表9 不同樣品質(zhì)量評價排序表
Tab. 9 Sorting table for quality evaluation of different products
3. 結語
建立了高效液相色譜多成分定量聯(lián)合化學計量學和熵權優(yōu)劣解距離法評價舒美寧膠囊質(zhì)量，通過優(yōu)化色譜條件，采用多成分、化學計量學以及熵權優(yōu)劣解距離法，選取不同廠家不同批次的舒美寧膠囊進行試驗。不同廠家的舒美寧膠囊大豆異黃酮含量存在一定差異，大豆異黃酮中大豆苷、染料木苷是影響舒美寧膠囊的主要成分，該方法專屬性強、準確度高，有助于生產(chǎn)企業(yè)完善產(chǎn)品質(zhì)量控制方法，為提高產(chǎn)品質(zhì)量和穩(wěn)定產(chǎn)品療效提供參考。
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來源：化學分析計量
