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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-02-27 20:16
摘 要： 建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定喘舒片中10種中藥活性成分的含量。采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）分離，以甲醇-0.2%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。在電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測負(fù)離子模式下掃描，以外標(biāo)法定量。10種中藥活性成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 3，檢出限為0.594～101.711 ng/mL。樣品的平均回收率為93.42%～108.62%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～6.6%（n=6）。該方法操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，可以為喘舒片的質(zhì)量控制和后續(xù)研究提供方法參考和數(shù)據(jù)支持。
關(guān)鍵詞： 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法； 喘舒片； 中藥活性成分； 質(zhì)量控制
喘舒片是一種在二十世紀(jì)八十年代在“雙黃片”基礎(chǔ)上改進(jìn)而成的中西藥復(fù)方制劑，主要用于治療慢性氣管炎。其組成成分包括升華硫、大黃粉、鹽酸雙氯醇胺和黃芩提取物，具有顯著的鎮(zhèn)咳、平喘和消炎作用[1]。升華硫?yàn)槠渲魉?，具有溫腎納氣、提高抵抗力的作用，在北方寒冷地區(qū)更易發(fā)揮療效[2]；大黃的主要活性成分包括蒽醌類、蒽酮類、鞣質(zhì)類[3-5]，具有瀉火解毒、抗菌消炎、清熱利濕的功效；黃芩提取物[6]中的多種黃酮類成分共同作用，例如漢黃芩苷、漢黃芩素具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎的作用[7]，野黃芩苷具有抗腫瘤作用[8]；鹽酸雙氯醇胺為選擇性較高的β2受體激動劑[9]，具有舒張支氣管平滑肌，緩解支氣管痙攣的功效。
現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中，鹽酸雙氯醇胺的含量測定采用紫外-可見分光光度(UV)法，企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中采用高效液相色譜(HPLC)法測定黃芩苷的含量和鹽酸雙氯醇胺的含量均勻度，同時也采用UV法測定鹽酸雙氯醇胺的含量。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，HPLC法[9-11]可用于測定鹽酸雙氯醇胺和黃芩苷的含量、HPLC波長切換法[12]可用于同時測定多種成分的含量。筆者課題組首次建立了測定喘舒片主藥升華硫中硫含量的HPLC測定法，對喘舒片中的硫含量進(jìn)行質(zhì)量控制。然而，喘舒片的藥效是多種活性成分協(xié)同作用的結(jié)果，只控制其中一種中藥活性成分無法全面的評價其質(zhì)量的優(yōu)劣。王瑞芬等[13]采用HPLC波長切換法測定了鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，需采用3種波長且檢測時間較長(60 min)、色譜柱耐受性較差。
筆者建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]同時測定喘舒片中大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、番瀉苷A、沒食子酸、漢黃芩苷、漢黃芩素、野黃芩苷10種中藥活性成分。該方法對于含量較低的成分，如沒食子酸、番瀉苷A，有較高的靈敏度，對被測成分在液相條件下的分離度沒有強(qiáng)制要求，具有較好的專屬性，可為更好的控制喘舒片的質(zhì)量提供參考。
1. 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：LC-20AD XR型，日本島津公司。
質(zhì)譜儀：AB SCIEX QTRAP 4500型，美國愛博才思公司。
電子天平：MS204TS型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器公司。
超聲波清洗器：KQ-600GDV型，昆山市超聲儀器有限公司。
甲醇、乙腈、乙酸：均為質(zhì)譜純，德國默克公司。
水：蒸餾水，廣州屈臣氏飲料有限公司。
大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、番瀉苷A、沒食子酸、漢黃芩苷、漢黃芩素、野黃芩苷對照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為99.3%、96.0%、99.4%、97.5%、99.2%、95.6%、91.5%、98.5%、100.0%、91.5%，批號分別為110757-201607、110756-201913、110796-201912、110795-202011、110758-201817、110824-202304、110831-201906、112002-201702、111514-202207、110842-202010，中國食品藥品檢定研究院。
喘舒片樣品：2022年度山東省藥品質(zhì)量風(fēng)險監(jiān)測任務(wù)中收集的具有代表性的樣品,均為糖衣片。
1.2 儀器工作條件
1.2.1 色譜儀
色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國沃特世公司)；流動相：A相為甲醇， B相為0.2%(體積分?jǐn)?shù))乙酸溶液，流量為0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL。洗脫方式：梯度洗脫,洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
Tab. 1 Gradient elution program
1.2.2 質(zhì)譜條件
離子源：電噴霧離子源（ESI）；電離模式：負(fù)離子模式；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；離子化電壓：-4 500 V；離子化溫度：550 ℃；噴霧器流量：50 L/min；氣簾氣流量：35 L/min；噴撞氣流量：8 L/min；輔助加熱氣流量：50 L/min。
1.3 溶液的制備
1.3.1 混合對照品溶液
分別精密稱取沒食子酸、番瀉苷A、野黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素甲醚、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚對照品適量，用甲醇作溶劑，制成質(zhì)量濃度分別為89.030、21.682、89.304、101.160、21.169、109.000、39.741、43.017、40.435、42.543 μg/mL的單一對照品儲備液。再分別精密量取10種單一對照品儲備液適量，制成質(zhì)量濃度分別為0.036、0.035、0.357、4.046、0.339、4.360、0.032、0.034、0.323、0.340 μg/mL的混合對照品溶液。
1.3.2 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液
分別精密量取單一對照品儲備液適量，制成含沒食子酸、番瀉苷A、野黃芩苷、漢黃芩苷、大黃素甲醚、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚對照品質(zhì)量濃度均分別為0.071、0.069、0.714、8.093、0.677、8.720、0.064、0.069、0.647、0.681 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.3.3 樣品溶液
取喘舒片樣品20片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約0.15 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz） 30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至標(biāo)線，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。
1.4 樣品測定
取樣品溶液與系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，在1.2儀器工作條件下進(jìn)樣檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以外標(biāo)法定量。
2. 結(jié)果與討論
2.1 樣品處理方法的優(yōu)化
分別以30%甲醇、60%甲醇、甲醇、30%乙醇、60%乙醇、乙醇溶液作為提取溶劑制備樣品溶液，結(jié)果表明，以甲醇作為提取溶劑時，色譜峰面積相對較大，因此選用甲醇作為提取溶劑；考察超聲及加熱回流兩種提取方式得到的圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種提取方式得到的圖譜相差不大，考慮到操作的簡便性，選擇超聲提取法作為樣品的提取方法；考察超聲15、30、45 min后得到的圖譜，發(fā)現(xiàn)超聲30 min與超聲45 min得到的圖譜相差不大，故選擇超聲時間為30 min。
2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化
采用針泵進(jìn)樣方式，以7.5 μL/min的流量向質(zhì)譜儀中注入200 ng/mL的單一對照品溶液，對每個目標(biāo)活性成分進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，包括去簇電壓和碰撞能量，根據(jù)質(zhì)譜響應(yīng)確定定量離子對，各活性成分在負(fù)離子模式下，有較高的質(zhì)譜響應(yīng)值，因此選擇負(fù)離子模式進(jìn)行定量分析。優(yōu)化后的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)見表2。
表2 多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)
Tab. 2 Multi-reaction monitoring mass spectrum parameters
2.3 色譜條件的優(yōu)化
水相中加入有機(jī)酸可以促進(jìn)目標(biāo)成分的離子化，其響應(yīng)值明顯增大，靈敏度增大。分別選擇甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05%乙酸溶液、乙腈-0.05%乙酸溶液、甲醇-0.1%乙酸溶液、甲醇-0.2%乙酸溶液、甲醇-0.3%乙酸溶液作為流動相，考察了不同流動相體系下的色譜圖，結(jié)果表明，以甲醇-0.2%乙酸溶液為流動相時，各色譜峰峰形和分離度較好，靈敏度較高，基線平穩(wěn)，故選擇以甲醇-0.2%乙酸溶液作為流動相。
考察了ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)和ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm) 2種型號的色譜柱。結(jié)果表明，2種色譜柱均具有良好的分離效果，但是各活性成分在ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱上有更好的色譜峰形，響應(yīng)強(qiáng)度較好，因此選擇ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱。
2.4 線性關(guān)系、檢出限和定量限
取系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用甲醇逐級稀釋，在1.2儀器工作條件下進(jìn)行測定，以各目標(biāo)物對應(yīng)的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并計算線性方程與相關(guān)系數(shù)。分別以3倍信噪比所對應(yīng)的質(zhì)量濃度確定目標(biāo)物的檢出限，以10倍信噪比所對應(yīng)的質(zhì)量濃度確定目標(biāo)物的定量限。10種中藥活性成分的的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表3。由表3可知，各成分的質(zhì)量濃度在各自范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 3，檢出限為0.594～101.711 ng/mL，定量限為1.979～339.036 ng/mL。
表 3 10種中藥活性成分的的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限
Tab. 3 Linear range, linear equation, correlation coefficient, detection limit and quantitation limit of 10 Chinese medicine active ingredients
2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取1.3.3處理的喘舒片樣品溶液1份，分別在樣品溶液制備后第0、2、5、7、10、12、24 h在1.2儀器工作條件下進(jìn)樣測定，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表4.由表4可知，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.5%～2.1%，該方法穩(wěn)定性良好。
表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 4 Results of stability test
2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)
取已知含量的喘舒片樣品約0.075 g，精密稱定，分別加入相當(dāng)于含沒食子酸9.793 μg、番瀉苷A5.637 μg、野黃芩苷58.941 μg、漢黃芩苷423.550 μg、大黃素甲醚5.292 μg、漢黃芩素152.600 μg、蘆薈大黃素5.961 μg、大黃酸3.872 μg、大黃素10.109 μg、大黃酚55.962 μg的混合對照品溶液，平行制備6份樣品溶液，在1.2儀器工作條件下進(jìn)行測定，計算加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收及精密度試驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知，樣品的平均回收率為93.42%～108.62%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.5%～6.6%(n=6)，表明該方法有較好的精密度和準(zhǔn)確度。
表5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果
Tab. 5 Results of standard recovery and precision test
3.結(jié)語
建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定喘舒片中10種中藥活性成分的含量。該方法操作簡單，檢出限低，靈敏度高，能夠準(zhǔn)確測定出喘舒片中的微量成分的含量，可為喘舒片的質(zhì)量控制、后續(xù)研究、有效監(jiān)管提供方法參考和數(shù)據(jù)支持。
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引用本文： 李敏，于姍姍，齊紅，等 . 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定喘舒片中10種中藥活性成分［J］. 化學(xué)分析計量，2024，33（11）：58. (LI Min, YU Shanshan, QI Hong, et al. Simultaneous determination of 10 kinds of active ingredients in Chuanshu Tablets by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(11): 58.)
來源：化學(xué)分析計量
