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1范圍

細胞毒性試驗是利用細胞體外培養方法來評價醫療器械或其浸提液可濾出成分中急性細胞毒性的潛在性。

2 試驗項目選擇（推薦）

根據GB/T16886.5-1997標準中有關細胞毒性試驗的要求，現推薦下面任何一種細胞毒性試驗方法評價醫療器械的細胞毒性，即瓊脂覆蓋法，分子濾過法，生長抑制法。

3 試驗條件

（1）細胞株

可以使用已建立的細胞株，目前我國使用較多的是L-929（小鼠結締組織成纖維細胞）和V-79（中國地鼠肺成纖維細胞）。

（2）培養基

培養基及其血清濃度的含量應能適合所選擇細胞株的生長，滿足細胞生長的需要。培養基內含抗生素的量應不引起細胞毒性，以免影響材料的評價，含血清和谷氨酰胺的培養基在2~8℃貯存不能超過一周，只含谷氨酰胺不含血清的培養基在2~8℃貯存不能超過一個月，培養基的pH值在7.2~7.4之間，所有培養用液都應是無菌的。

（3）樣品的制備

• 試驗樣品的制備。試驗樣品應選擇材料本身或其浸提液進行。試驗材料應用最終產品。制備材料浸提液的條件往往是夸大臨床應用的條件來評價樣品潛在的細胞毒性，但不能引起樣品嚴重的變化（如溶解或其化學結構改變），浸提液應在制備后的24h內使用；固體材料應至少有一個平面使其利于在細胞層或瓊脂層相接觸，各種試驗樣品在試驗時均應經無菌處理。

• 陰性對照。應是已知無細胞毒性的物質。對于合成高分子材料，高密度聚乙烯較為適宜，牙科材料則可用氧化鋁陶瓷作為陰性對照。

• 陽性對照。是已知的有一定細胞毒性的物質。推薦含錫的聚氯乙烯作為固體材料或浸提液的陽性對照。稀釋苯酚亦可作為浸提液的陽性對照。

4 試驗方法

1)瓊脂覆蓋法

• 目的：本試驗是為了評價醫療器械科浸提成分的急性細胞毒性。
• 范圍：本試驗方法適用于固體（粉末，纖維狀，金屬），液體等試驗材料。
• 試驗樣品的制備。

試驗樣品：將試驗樣品制成100mm2的圓形，要求邊緣光滑整齊。液體材料用0.1mL的樣品吸收在同面積的無菌濾紙片或纖維素上。

陰性對照：為已知五毒的材料（反應指標為0/0）高密度聚乙烯由于有良好的光學性質且易于切割被認為最為適宜。制備方法用試驗樣品。

陽性對照：為已知的有一定毒性的樣品材料（反應指標為2/2），含錫的聚氯乙烯是一種較為合適的陽性對照。制備方法同試驗樣品。

細胞株：推薦使用L-929細胞株。試驗用細胞為傳代（48~72）h生長旺盛的細胞。

培養基和試劑：用于細胞培養液都應無菌。

磷酸鹽緩沖液（PBS-Complete）:

加水至1000mL,過濾滅菌，4℃貯存。

中性紅濃縮液：

加水至2000mL，用磁力攪拌器攪拌1h后，濾紙過濾，高壓消毒，4℃避光保存。

中性活體染液：

避光，新鮮配備。

消化液：為0.25%胰酶與0.2%EDTA混合液，其配比為1:9.

培養液：為Eagle’sMEM，內含牛血清10%~15%（胎牛血清最好），青霉素、鏈霉素為每毫升培養液100單位。

Eagle’s 瓊脂培養基：

把加熱熔化的瓊脂和2倍Eagle’s培養基無菌混合后置50℃水浴中備用。

試驗平板：90mm直徑的玻璃培養皿，按組織培養常規滅菌。

試驗步驟（在無菌條件下進行）

制備細胞懸液：將傳代（48~72）h細胞經消化液作用后，使貼壁細胞懸浮于營養液中，調節細胞懸液濃度至3×10^5個細胞/mL。

制備平板細胞單層：每只平板中加入10mL制備好的細胞懸液，輕輕轉動培養皿，以使細胞均勻的分布在培養皿底部。放入含5%CO₂的37℃恒溫培養箱中培養24h，使其成為融合但不稠密的網狀細胞單層。

制備瓊脂培養基平板：細胞原培養液，留下融合好的細胞懸液，將混合的Eagle’s瓊脂培養沿平皿壁加入平皿內，每皿10mL.輕輕轉動平皿，使瓊脂培養基分布均勻，并使其在室溫下凝固。

染色：有兩種方法可供選擇。取10mL新鮮配制的中性紅活體染色，輕輕地置于已凝固的瓊脂表面中央，染液應覆蓋整個表面，避開強光，37℃染色15min，傾斜平板并棄去多余染液；將中性紅染液加入熔化的Eagle’s瓊脂培養基（0.1mL中紅加入10mL培養基中），混合后覆蓋于細胞單層上。

放置試驗樣品：應立即放置樣品，最遲不超過染色后1h。

將樣品對稱地放在瓊脂表面，可輕輕加壓以瓊脂表面接觸，但不可破壞瓊脂表面，在放置樣品30min內將培養放入CO₂培養箱內培養24h。

試樣位置：一只陰性樣品，一只陽性樣品和良知相同的試樣對稱地放置在培養皿的瓊脂表面，試樣邊緣距培養皿的邊緣15mm，每一種試驗樣品至少做兩只培養皿。

結果評定標準

在白色背景下，觀察樣品周圍及樣品下面脫色區范圍。在陰性樣品周圍和下面的細胞單層應達到標準的反應，即R=0/0，陽性樣品亦應達到標準反應，即R=2/2，否則該培養皿棄之。

反應指標：反應情況用反應指標“R”來表示，即

R=Z/L

式中，Z為區域指標（如表1-4-1所示），與脫色區大小有關；L為細胞溶解指標（如表1-4-2所示），與區域細胞溶解的范圍有關。

表1-4-1 區域指標

表1-4-2 溶解指標

反應指標應作為2個數來報告（不是一個分數），兩個指標的大小都應很明顯，對每一只樣品應報告其區域指標的指標平均值和溶解指標的平均值。無論何種原因，一個指標的四個值丟失了一個以上，則該試驗棄之，如僅丟失了一個，則其他三個的平均值可作為指標來報告。

在同一試驗中，4個相同的樣品指標大小有2個或2個單位以上的差異。如果數值在0~3以內，則應重復試驗；如數值是4~5，表示有高度彌散的毒性物質，則不必重復試驗。

為了試驗的可靠起見，規定每種樣品重復試驗一次以上，最后報告其指標的平均值。

試驗報告

包括試驗材料和陰、陽對照材料的化學名稱、商品名稱、產品批號、生產廠家以及材料試驗尺寸規格與消毒方式。

指出試驗用細胞名稱、來源、培養基種類。

描述操作步驟：包括制備細胞懸液、制備細胞單層、覆蓋瓊脂、染色等。

顯微鏡下觀察試驗結果。

對試驗材料進行評價

2）分子濾過法

目的：本試驗用于試驗材料的細胞毒性評價。

試驗材料的準備。

試驗樣品

按照生產廠家的產品說明準備試驗樣品，將試驗樣品制備成直徑7mm的圓形膜片，要求有一個平面，使其可以充分地與濾膜接觸，試驗樣品的質量不應超過3g，亦可用直徑為7mm的纖維素片汲取0.1mL浸提液放置在分子濾膜片上。

空白對照樣品：只長在單層細胞的分子濾膜或單純的分子濾膜。

陽性對照樣品：推薦使用稀釋的苯酚溶液作為陽性對照樣品。

細胞株、培養基

細胞株：人上皮細胞株（HeLa）、小鼠結締組織成纖維細胞株（L-929）。

培養基：用于細胞培養的培養用液都應是無菌的。

生長培養基：采用Eagle’s培養基，加10%胎牛血清，1×10^5IU/L青霉素，100mg/L鏈霉素及10mmol鏈霉素和10mmol/L HEPES緩沖液。

試驗步驟

消化收集細胞并用生長培養基調節細胞濃度為1.5×10^5/mL,在直徑為50mm組織培養皿中放置的直徑47mm、孔徑0.45μm的分子濾膜加上6mL細胞懸液，在5%二氧化碳培養箱內培養24h。

加5mL約40℃的瓊脂培養基于一空白的組織培養皿內，使其室溫下凝固。將用37℃磷酸緩沖液漂洗后的附有單層細胞的分子濾膜，細胞面向下放置在瓊脂培養基面，每一濾膜上放置3~5個樣品，每種材料測10個樣品，空白對照和陽性對照操作方法相同。放置樣品后，在5%CO₂培養箱內繼續培養2h。

培養后移去試驗樣品并輕輕地從瓊脂培養基上拿下分子濾膜，用細胞化學方法來測定細胞單層的琥珀酸脫氫酶的活性。37℃孵育3h后，用蒸餾水洗滌。風干。

結果評價

在顯微鏡下檢查濾膜，含細胞單層的膜片染為深藍色，沒有細胞的濾膜用來觀察試驗材料可能對濾膜產生的影響。按照表1-4-3判斷試驗樣品的細胞毒性。

按照記分系統，對材料的細胞毒性進行分級、報告。

3）細胞生長抑制法[MTT（四咪唑）比色法]

（1）細胞株：L-929（小鼠結締組織成纖維細胞）。

（2）儀器：免疫酶標儀。

（3）培養液和試劑

培養液：詳見瓊脂覆蓋法。

消化液：詳見瓊脂覆蓋法。

PBS緩沖液：詳見瓊脂覆蓋法。

MTT（四咪唑）：濃度為5mg/mL溶于PBS中。

（4）樣品制備：將無菌的樣品浸在培養液中（含10%胎牛血清）靜置24h，浸提液量與樣品表面積之比為10mL/cm²,浸提液制備好后，將其一般用培養液稀釋成溶度為50%.

（5）培養（1~2）d的L-929細胞，吸收原培養液，加入消化液，消化，吸收消化液，加入新配置的培養液，使細胞成懸浮液計數，稀釋成1×10^4個細胞/mL。接種于3塊96孔塑料板上，每組4孔，每孔100μL。在37℃CO₂培養箱中培養24h，使細胞貼壁，24h后，加樣品，將每孔中原培養液吸除。空白對照加新配置的培養液100μL，試驗組分分別加100%和50%樣品浸提液，放入37℃CO₂培養箱中培養，在2d、4d、7d時，分別各取出一塊培養板，吸除樣品浸提液加入20μL/孔MTT液，繼續培養6h，然后吸除，再加入150μL/孔二甲基亞砜，振蕩10min，在免疫酶標儀上以500nm波長測吸收值，通過下式計算相對增殖率（RGR）：

（6）結果評價：根據RGR均值，岸標1-4-4所列評分標準對樣品細胞毒性程度進行評價。

表1-4-4 細胞相對增殖率評價

參考：徐秀林. 無源醫療器械檢測技術[M]. 北京：科學出版社，2007：17-22.