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磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制劑是一類抑制磷酸二酯酶活性的藥物，被用于治療男性勃起功能障礙等疾病。由于其特殊的功能主治和市場需求，在抗疲勞類保健品中添加PDE-5抑制劑成為不法廠商謀取暴利的手段，其中以添加西地那非、他達拉非和伐地那非等PDE-5抑制劑最為常見。為此，2009年原國家食品藥品監督管理總局陸續頒布了用于監管中成藥及保健食品中非法添加PDE-5抑制劑的補充檢驗方法，對不法行為起到了有效的震懾。但隨著監督查處工作力度的不斷深入，陸續報道發現一些現行檢驗標準中未涵蓋的新型PDE-5抑制劑。這些新型PDE-5抑制劑大多是西地那非衍生物，由于國內無相關檢驗標準，可能被檢驗人員忽略，危害消費者健康，進而擾亂保健食品市場秩序。

筆者在宣稱抗疲勞的保健食品中通過“異常色譜法”發現一種西地那非衍生物，通過高效液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）技術以及核磁共振氫譜（1H-NMR）技術對其結構進行解析，并結合國外文獻分析，最終確定該化合物為去甲基卡波地那非（Desmethyl Carbodenafil）。

1 材料

1.1 材料與設備

甲醇（色譜純，美國迪馬公司），乙腈（色譜純，美國迪馬公司），甲酸（色譜純，天津科密歐公司）；二級純化水；抗疲勞的保健食品來源于抽檢案件；去甲基卡波地那非對照品（純度99.7%，購自加拿大TLC pharmachem公司）。

1.2 儀器與設備

LC-MS8050液質聯用儀（日本島津公司）；Ultimate3000高效液相色譜儀（美國賽默飛公司）；CheetahHP100制備液相儀（天津博納艾吉爾公司）；Bruker Plus 600核磁共振儀（德國Bruker公司）；MS-204S電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

2 方法

2.1 高效液相色譜方法

參照文獻中高效液相色譜條件。色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 µm），柱溫：35 ℃；流速：1 mL·min-1；流動相：A為磷酸三乙胺溶液（取三乙胺7 mL，用水稀釋至1000 mL，用磷酸調pH至2.8）-甲醇-乙腈（60︰20︰20），B為磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈（8︰46︰46），梯度洗脫：0~12 min，0%B；12~25 min，100%B；25~30 min，100%B；30~31 min，0%B；31~36 min，0%B；二極管陣列檢測器；檢測波長：230 nm；掃描范圍：200~400 nm。

2.2 高效液相色譜-質譜聯用方法

參照文獻液質聯用色譜條件。色譜柱: Dikma Spursil C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 µm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；梯度洗脫：0~1 min，10%B；1~4 min，40%B；4~7 min，90%B；7~9 min，90%B；9~9.1 min，10%B；9.1~12 min，10%B；流速：0.3 mL·min-1；進樣量2 µL；柱溫35 ℃。質譜條件：采用電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描模式；多反應檢測（MRM）；霧化器流速：3 L·min-1；加熱器溫度：400 ℃；干燥氣流速：10 L·min-1；加熱氣流速：10 L·min-1；接口溫度：300 ℃；噴霧電壓：4.5 kv。

2.3 分離純化方法

稱取7 g樣品，用125 mL乙腈超聲（功率：250 W頻率：33 Hz）提取20 min，8000 r·min-1離心8 min，0.22 µm尼龍濾膜濾過，旋轉蒸發至10 mL，加10 mL乙醇超聲（功率：250 W頻率：33 Hz）溶解，加10 mL二甲基亞砜稀釋。采用Venusil MP C18（100 mm×250 mm，5 µm）色譜柱。流動相A為0.1%甲酸水，B為乙腈；梯度洗脫：0~3 min，B 10%；3~43 min，B 10%~50%；波長230 nm下收集主色譜峰，冷凍干燥，即得純化物。

2.4 核磁氫譜方法

稱取5 mg純化樣品，加入氘代氯仿溶解，使用5 mm PABBO探頭，1H觀察頻率為600.23 MHz，進行1H-NMR測試。

2.5 對照品溶液制備

精密稱取對照品8 mg，置25 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 µm有機濾膜濾過，即為HPLC對照品溶液。將對照品溶液稀釋至每1 mL含有100 ng溶液，作為MS對照品溶液。

2.6 供試品溶液制備

精密稱取待測樣品0.1 g，置10 mL容量瓶中，加乙腈8 mL超聲（功率：250 W頻率：33 Hz）15 min，放冷至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，0.22 µm有機濾膜濾過，即為HPLC供試品溶液。將HPLC供試品溶液用乙腈稀釋至每1 mL含有100 ng溶液，作為MS供試品溶液。

3 結果與分析3.1 高效液相色譜分析

在樣品的色譜圖中發現一個色譜峰，保留時間為7.980 min（見圖 1）。在209 nm和295 nm處有最大吸收波長（見圖 2）。與補充檢驗辦法（編號2009030）所列11種非法添加物保留時間及光譜圖均不一致，進一步通過質譜分析。

圖 1 樣品色譜圖（A）與去甲基卡波地那非對照品色譜圖（B）

圖 2 樣品（1）和去甲基卡波地那非對照品（2）紫外光譜圖

3.2 質譜解析

對樣品進行一級和二級質譜全掃描分析（見圖 3）。結果顯示分子離子峰[M+H]+=439.20，二級質譜的主要裂解碎片離子（m/z）分別為339.15，311.05。與文獻比較，發現比卡波地那非質荷比少14，同時含有相同的碎片離子m/z 339，m/z 311。推斷可能是卡波地那非失去甲基形成的，進一步通過核磁氫譜解析。

圖 3 樣品一級質譜圖（A）和二級質譜圖（B）

3.3 1H-NMR解析

經制備液相純化，得到類白色的固體化合物18.4 mg，純度為98.9%。該化合物核磁氫譜解析結果：1H NMR（600 MHz，Chloroform-d）δ11.01（s，1H），8.60（d，J = 2.3 Hz，1H），7.60（dd，J = 8.5，2.3 Hz，1H），7.11（d，J = 8.6 Hz，1H），4.36（q，J = 7.0 Hz，2H），4.29（s，3H），3.84（s，2H），3.70（s，2H），2.94（t，J = 7.6 Hz，2H），2.59（s，4H），2.43（s，3H），1.89（h，J = 7.4 Hz，2H），1.65（t，J = 7.0 Hz，3H），1.05（t，J = 7.3 Hz，3H）。與文獻中報道的去甲基卡波地那非核磁共振氫譜[24]對比，信號一致，確證該未知化合物為去甲基卡波地那非，化合物結構見圖 4。

圖 4 去甲基卡波地那非結構

3.4 樣品測試

為進一步確認，后經與對照品比對，結果確證未知物為去甲基卡波地那非。

3.4.1 質譜測定

經與去甲基卡波地那非對照品比對，確證樣品與對照品一級和二級質譜圖（見圖 5）相一致。根據二級質譜碎片推斷去甲基卡波地那非的裂解機理（見圖 6）：母離子m/z 439.20失去哌嗪環形成碎片離子m/z 339.15，再失去乙基，得到碎片離子m/z 311.05。

圖 5 去甲基卡波地那非對照品一級質譜圖（A）與二級質譜圖（B）

圖 6 去甲基卡波地那非質譜裂解規律

3.4.2 含量測定

采用高效液相色譜法測定，去甲基卡波地那非對照品保留時間為7.850 min，其最大吸收波長為209 nm和295 nm，與樣品一致。同時計算得出樣品中去甲基卡波地那非含量為5.015 mg·g-1。

4 討論

在抗疲勞類保健食品中發現的新化合物經HPLC-DAD、LC-MS/MS和1H-NMR確證，該化合物為5-（5-（4-甲基哌嗪-1-羰基）-2-乙氧苯基）-1-甲基-3-丙基-1H-吡唑[4，3-d]嘧啶-7（6H）-酮，命名為去甲基卡波地那非。該化合物未在國內報道，沒有相關檢驗標準，因此，有必要完善檢驗標準，為打擊不法行為提供技術支撐。

去甲基卡波地那非在市場上并沒有合法來源，可能不法分子通過自制的化工原料添加到保健食品或功能性食品中，由于添加劑量隨意，且未經過系統的毒理學研究，消費者在不知情的情況下日常服用添加該類化合物的保健食品，會對人體健康帶來巨大危害，國外已有服用該化合物致死案例的報道。

王珂 1, 董培智 2, 申國華 2, 張祿 2, 梁卜文 2, 郭景文 2