您當前的位置：檢測資訊 > 科研開發
嘉峪檢測網 2020-09-22 17:06
1 引言
生物活性分析（Bioassay）主要是指檢測生物藥物活性/效價（Potency）的方法，生物活性是生物藥至關重要的CQA（critical quality attribute），是確保藥物有效性的最重要指標。因為蛋白藥物/抗體結構和活性的復雜性，生物活性分析一直是生物藥行業質量分析中最具有挑戰性的工作，如何持續地獲得可靠和準確的結果是整個行業所需要突破和進化的。
2 生物活性分析開發的根據
穩定的活性分析結果需要受控的環境、經確認/校準的儀器、合格的試劑，經驗豐富且理解細胞生物學、了解監管要求和最新技術趨勢的分析人員，使用的分析方法需要經過完整的開發、表征和詳細的方法學驗證（可參見GMP 6大原則，參考文獻1）。統計學分析（statistics）和風險管理RM（risk management）作為制藥行業質量管理中廣泛使用的工具，在生物活性分析的開發、驗證和全生命周期（life-cycle）也能有效減少我們的工作量，提高數據的可靠性。
在生物活性分析的新方法開發中，面對新的活性藥物成分（API）或生物類似藥（biosimilarity）的復雜性質和/或嚴苛的相似性指標考慮，更多地需要引入統計學方法來為流程化方法開發和申報資料提供可靠的數據區間和新的解決思路。一般來說，耐用性（robust）良好的生物活性分析對于表征和監控產品活性至關重要，確保在存在變化的條件下依然能獲得穩定的結果可以有效加速藥物的開發、申報和上市。
2.1 質量源于設計（QbD）
質量源于設計（QbD）和試驗設計（DoE）在生物活性分析中通常被用來研究方法的耐用性。DoE可以用來對API濃度、孵育時間、細胞密度、培養時間、顯色方式等進行組合設計，但由于生物活性分析存在較大的變異性，通常對于一個條件需要進行重復試驗以獲得重復性（repeatability）和準確度（accuracy），其應用于方法驗證的話則可能需要的試驗次數太多。
而結合分析方法質量源于設計（AQbD）思維的DoE可以有效減少試驗次數，從而在方法開發階段通過設定符合質量研究目標和方法，通過RM分析影響分析方法可靠性的參數，采取降低風險的措施，設置合理的設計空間，并通過方法驗證制定最終的控制空間。由于現實條件的限制，目前大多數的生物活性法方法開發中都很難執行真正有效的AQbD，但在方法開發中引入AQbD進行方法的耐用性考察和驗證方案的設計對于方法的持續優化、驗證和數據的可靠性都具有重要的意義。
2.2 統計學
在生物活性分析的參數選擇和考察中，除了常規的分析方法重復性、準確度的計算外，統計學可以劑量效應曲線在相似性判斷中起到重要的作用。如F-統計常用來判斷斜率的相似性（參考文獻3）。
近年來，USP中關于生物活性分析的章節1032、1033、1034正日益被用來指導生物活性分析的設計和開發。而在ChP 3531中，尼妥珠單抗生物學活性的測定中規定供試品和對照品的平行性假設需不被否定（P＞0.05）；在ChP 3535中，康柏西普相對結合活性的測定中規定標準品與待測樣品的上漸進線（四參數曲線的D值）比值為0.80~1.25，下漸近線（四參數曲線的A值）比值為0.60~1.67之間，標準品與待測樣品斜率（四參數曲線的B值）比值為0.80~1.25之間，前7個濃度點，兩重復孔OD值CV%不大于15%，實驗方為有效（參考文獻3）。這些試驗的可接受標準既代表了監管機構的強制要求，也要求我們在方法研究中盡可能地使用統計學根據以從大量隨機性的數據中獲得生物活性分析的規律。
3 生物活性分析驗證
3.1 生物分析方法的偏差來源
在生物活性分析的方法驗證中，多種因素導致的偏差會使方法驗證工作進行的相當困難。如在常用的基于細胞的生物學活性分析方法研究中，包括以下因素都會導致偏差產生，如（參考文獻1）：
細胞代次不同照成劑量效應曲線變化；
96孔板的邊緣孔液體蒸發，即邊緣效應；
96孔板中氧氣和二氧化碳的交換；
細胞培養箱溫場的不穩定性和不均勻性導致96孔板內產生溫差；
樣品制備、稀釋過程中導致板內藥物濃度不一致，如多通道移液器各孔道的不一致性，槍尖殘液；
酶標儀讀數的偏差等。
因此，在生物活性分析的開發中需要考慮到這些因素，確保使用的儀器設備處于受控的狀態，從稀釋的均勻性，移液的一致性，樣品的排布進行綜合考慮，如在96孔板內增加緩沖區以避免邊緣孔的蒸發，加用濕盒保持飽和濕度，規定移液方式、梯度稀釋混勻次數等多方面保證實驗的一致性（參考文獻4）。
3.2 生物活性分析的驗證設計
生物活性分析的方法驗證通常需要進行多次試驗以獲得足夠的數據對方法的各項參數進行分析。為達到驗證工作的合規性和工作量的合理性的平衡，除參考常規的分析方法驗證指南外（如ChP 9101），通?？稍诜椒炞C中對除專屬性以外的指標進行合并設計（準確度、精密度、線性和范圍）。在ChP 9401中，分別對基于細胞的體外生物學活性和基于動物的體內生物學活性給出了示例（參考文獻3）：
在人粒細胞刺激因子生物學活性測定法（NFS-60細胞/MTT比色法，ChP 3525）驗證中，采取在對數尺度上呈均勻間隔的相對效價水平64%、80%、100%、125%、150%，每個效價水平由2名分析人員在不同日期使用4個細胞代次進行測定，通過合并設計得出相對準確度、中間精密度（重復性）、線性和范圍指標。
考察的統計學參數包括相對準確度（相對偏倚應應不大于±12%并報告期置信區間上限，且理論效價值與測定值的對數線性擬合斜率應在0.80~1.25之間）、中間精密度每個測定值的幾何變異系數（GCV）應不高于20%、線性（理論效價值與測定值的對數線性擬合相關系數應不低于0.98）、范圍（報告相對準確度、中間精密度和線性符合要求時的效價水平范圍，該范圍應至少涵蓋相對效價的質量標準80~150%）。
在卵泡刺激素生物活性分析（ChP 1216，大鼠卵巢增重法）中，同樣對以上四項指標進行合并設計，選擇在對數尺度上呈均勻間隔的80%、100%、125%，每個效價水平獨立測試3次，四項指標參數與以上例子相同。
4 生物活性分析的生命周期管理
在驗證完成后生物活性分析就可以開始使用，但仍需要對其性能進行持續的監控。最常用也是最簡單的監控方法是選取適宜的參數進行統計過程控制（SPC）圖進行檢測，如標準品的劑量反應曲線和質控品、樣品的效價測定值等（參考文獻3）。通過SPC圖可以有效識別到方法的漂移和波動，并應及時進行歸因分析，95%置信區間（95%CI）也有助于對混雜的數據進行統計。
當藥品的生產工藝變更、制劑組方變更等發生時，應評估這些變更對方法造成的修訂和質量標準的改變，重新進行完整的方法驗證或通過橋接將原始測定數據過度到修訂方法。此外，對于已驗證的方法發現其不適合設計的使用用途時，應及時開發更穩定的生物活性分析以避免監管機構對于產品性質的質疑。
5 小結
生物活性分析通常是生物藥開發中的重要限制因素，需要在GXP的基本要求下，通過AQbD指導方法開發，通過RM識別方法的主要變異點，采用合適的統計學參數對結果進行分析和報告，并加強方法的生命周期管理，從而獲得持續穩定的生物活性分析的數據，對于生物藥的申報和上市都能產生很好的促進作用。
參考文獻
1 Cheryl Scott, Laureen Little, Nadine Ritter and Michael Sadick. BioassayEvolution: Finding Best Practices for Biopharmaceutical Quality Systems.BioProcess Int. Janurary 2020.
2 Das RG, Robinson CJ. Assessing Nonparallelism in Bioassays: A Discussionfor Nonstatisticians. BioProcess Int. November 2008.
3 Chp 2020.
4 Neeley C. Reducing the Edge Effect. Accelerating Science 27 June 2016.
來源：藥事縱橫
