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嘉峪檢測網 2021-02-20 23:58
摘 要 / Abstract
近兩年制藥行業接連從纈沙坦、雷尼替丁、二甲雙胍等藥物中發現亞硝胺類雜質殘留，反映出原有的基因毒性雜質的評估與控制策略存在著一些問題和缺陷，表明制藥工業界和監管部門對亞硝胺基因毒性雜質的認知需要一定的發展和提升空間。如何避免亞硝胺類雜質殘留事件的發生，對于制藥工業界和監管部門都是一個巨大的挑戰。本文簡要的回顧了基因毒性雜質的歷史和現狀，對各國監管部門的應對策略進行解讀，并對纈沙坦、雷尼替丁、二甲雙胍等藥物中產生亞硝胺類雜質的機制進行探討。筆者結合文獻資料、ICH 指導文件以及近期監管部門發布的相關指導原則，從基因毒性雜質識別、原料藥和成品工藝風險評估、毒理學評估、控制策略、分析方法等方面進行闡述，以期助力基因毒性雜質研究的進一步發展。
The presence of nitrosamine impurities in valsartan, ranitidine, metformin and other drugs has been reported one after another in the past 2 years, which reveals problems with the original risk assessment and control strategy of genotoxic impurities. These events also indicate that it takes time and a progressive process for both the pharmaceutical industry and the regulators to have a profound and complete understanding of nitrosamine impurities. It is a great challenge, facing the industry as well as the regulators, to prevent these events from happening. This paper briefly reviews the history and current situation of genotoxic impurity studies, examines control and mitigation strategies by regulators of different countries/regions, and discusses the plausible mechanisms for nitrosamine formation in sartans, ranitidine and metformin. Based on literature, ICH guidance and relevant guidelines recently issued by regulators, the authors elaborate on the identification and evaluation of genotoxic impurities,risk assessment of drug substance and finished product processes, toxicological assessment, process control strategy and analytical methods in an effort to formulate an effective and readily implementable control strategy for genotoxic impurities.
關鍵詞 / Key words
基因毒性雜質；ICH ；亞硝胺；風險評估；控制策略；分析方法
genotoxic impurities; ICH; nitrosoamine; risk assessment; control strategy;analytical method
基因毒性雜質（genotoxic impurities，GTI）又稱遺傳毒性雜質，是指化合物本身能直接或間接損傷細胞DNA，產生基因突變或體內誘變，具有致癌可能或者傾向。研究基因毒性雜質的根本目的是控制和降低其在人體中可能引發癌癥的風險。致癌物按作用機制可分為基因毒性致癌物與非基因毒性致癌物，藥物研發與生產中遇到的致癌物絕大部分是基因毒性致癌物。基因毒性致癌物的主要作用機制是造成DNA 損傷，而非基因毒性致癌物的作用機制比較復雜，包括氧化應激、酶活性的調節、細胞增殖與細胞凋亡等。對于化學物質可能引發癌癥的毒性，可分為基因毒性、致突變性和致癌性3 個層面。絕大部分致癌物和誘變劑都具有基因毒性，但并非所有的基因毒性雜質都具有致突變性或致癌性。
藥物的基因毒性雜質與普通雜質研究的前期發展歷程相似，兩類雜質均是從20 世紀80 年代末~90 年代初開始系統研究。推測其原因可能是由于隨著藥物分析的不斷發展，更靈敏的儀器如高效液相色譜（HPLC）等開始被大規模地應用于藥物分析和檢測，因此一些藥物雜質（包括基因毒性雜質）逐漸被檢測出。同時，隨著對基因毒性雜質認知的不斷發展，相關的監管指南也在不斷更新。近幾年，制藥行業接連從沙坦類、雷尼替丁、二甲雙胍等藥物中發現亞硝胺類雜質殘留[1]。如何避免亞硝胺類雜質殘留事件的發生，對制藥工業界和監管部門都是一個巨大的挑戰。
1、基因毒性雜質的定義、性質與分類
在藥物研發的實際工作中遇到的基因毒性雜質， 絕大部分是烷基化試劑（alkylating agents），其化學基礎為親電性，即其本身是親電試劑（electrophiles）。這是由于雙螺旋DNA 分子含有4 種堿基，分別是腺嘌呤（adenine，A）、胸腺嘧啶（thymine，T）、鳥嘌呤（guanine，G）和胞嘧啶（cytosine，C），見圖1。這4 種堿基均為親核試劑（nucleophiles），因此親電的烷基化試劑能夠和親核的DNA堿基發生化學反應。如鳥嘌呤（圖2）發生烷基化的位點主要在O-6 位和N-7 位，其中O-6 位點的烷基化比較容易誘導基因毒性的產生。烷基化試劑可分為直接烷基化和間接烷基化試劑2 種。通常親電性越強，其基因毒性越強，特別是需要經過代謝激活產生的基因毒性雜質（如間接烷基化試劑）。然而，對于直接烷基化試劑，當其反應活性太活潑時，其基因毒性反而可能減小。這可能是因為這類物質在還未進入細胞或未達到DNA 作用靶標時就已在體內分解，而在體內分解時所發生的化學反應也可能導致這類物質產生其他毒性。
1968 年Singer 等[2] 首次報道了亞硝基胍的化學反應，1- 甲基-3- 硝基-1- 亞硝基胍（MNNG）在堿性條件下分解，經脫水反應生成重氮甲烷，重氮甲烷本身也是一個很強的烷基化試劑，進一步反應形成更加活潑的烷基化試劑，即甲基正離子（圖3）。與亞硝基胍的化學反應相似，纈沙坦中發現的N- 亞硝基二甲胺（NDMA）雜質，通過代謝激活，也產生了同樣的中間體，經脫水反應產生重氮甲烷，進一步反應生成甲基正離子。這2 種烷基化試劑均能與DNA 發生烷基化反應，生成甲基化DNA（圖4）。直接烷基化試劑如硫酸二甲酯（dimethyl sulfate，DMS），可與DNA 一步反應生成甲基化DNA（ 圖5）。
除了烷基化試劑外， 其他類型的基因毒性物質：如DNA 嵌入劑（DNA intercalator）阿霉素，是由阿霉素分子的平面部分嵌入到DNA 雙螺旋結構（圖6）；重金屬離子（heavy metal ions）可以與DNA 雙螺旋的堿基鍵合；輻射（radioactivity）能造成DNA 鏈的斷裂和交聯，使DNA 遺傳特性發生改變，產生基因毒性。
在靶向藥物出現以前，有相當一部分化療藥物（包括大部分抗癌藥）實際上是具有基因毒性的藥物。如治療腦癌的一線用藥替莫唑胺（temozolomide，圖7），能通過血腦屏障，最終分解形成甲基正離子。由此可知，基因毒性藥物具有兩面性。此類基因毒性藥物對正常細胞和癌細胞沒有區分能力，對人體快速生長的細胞組織（如毛發）同樣也有抑制作用，所以接受這類傳統化學藥物治療的癌癥患者，通常會有脫發的現象，而通過靶向藥物治療的患者不良反應中一般沒有脫發。
2、基因毒性雜質研究與監管簡史
（一）基因毒性雜質相關的指南
1997 年首次發布的ICH Q3C《雜質：殘留溶劑的指導原則》（Impurities:Guideline for Residual Solvents）中對具有遺傳毒性的溶劑進行了限度規定；2006年1 月FDA 發布了行業和評審人員指南《推薦的遺傳毒性試驗結果綜合分析法指導原則》（Guidance for Industry and Review Staff: Recommended Approachesto Integration of Genetic Toxicology Study Results），有關于遺傳毒性研究數據整合的推薦方法；2006 年歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）人用藥品委員會（CHMP）發布了《基因毒性雜質限度指南》（Guideline on the Limits of Genotoxic Impurities）；2014 年首次發布的ICH M7《評估和控制藥物中的DNA 活性（致突變）雜質以限制潛在的致癌風險》[Assessment and Controlof DNA Reactive (Mutagenic) Impuritiesin Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk] 是協調了各方意見后發布的第1 個基因毒性雜質研究和控制的指南，其標題本身便指明了該指南的目的是評估和控制藥物中具有DNA 反應活性（致突變）的雜質，以限制其在人體中的潛在致癌風險；2018 年3 月更新了該指南，最新版為ICH M7（R1）。此外， 在ICH M7（R1） 的附錄中， 列出了14 個常見基因毒性雜質的可接受攝入量（acceptable intakes，AIs）， 如4- 氯苯胺的終生可接受攝入量（lifetime AI）為34 μg/d ；氯乙烷的終生可接受攝入量為 1810 μg/d。需要指出的是，這些限度高于根據毒理學關注閾值（threshold oftoxicological concern，TTC）原則設定的、對于沒有特定毒理學數據的潛在基因毒性雜質的限度（1.5 μg/d）；特別是氯乙烷的限度比普通雜質的限度要高很多，在國際癌癥研究機構（International Agencyfor Research on Cancer，IARC） 的分類中將其歸類為3 類化合物，即目前沒有足夠證據表明能在人體導致癌癥的化合物（需要特別注意，由于IARC 的分類與ICHM7 的分類及含義不同，因此不能混淆）
而在亞硝胺類雜質殘留事件發生后，各國監管部門出臺了一系列對亞硝胺風險評估和控制的指導文件[3-6]。
（二）警示結構
基因毒性雜質的風險評估，首先需要關注被評估的化合物是否具有警示結構。警示結構有很多種，其中絕大部分是親電基團或經過代謝激活后可以轉換成親電基團的結構。1988 年Ashby 等[7] 假設了一個超級化合物，將很多警示結構包括在此假設化合物中（圖8）。而具有警示結構的化合物并不一定具有基因毒性，只是其具有基因毒性的可能性較一般化合物高，但如果不對具有警示結構的化合物做進一步的毒理學評估，它們即是潛在的基因毒性雜質（potential genotoxic impurity，PGI），需要作為基因毒性雜質（genotoxicimpurity，GI）來控制，因此有時這2 個術語可能被混用。隨著對于警示結構與基因毒性雜質認知的不斷深入，這個超級化合物中包含的警示結構需要不斷更新，原有的一些警示結構可能由于當時的數據局限或對數據分析的不完整，會被不恰當地歸入。如吡啶氮氧化物，近期研究顯示其引起基因毒性的可能性很小[8]，但是由于被不恰當地歸入警示結構，在申報人提交新藥申報申請時，不論是國內還是國外，在涉及吡啶或吡啶類化合物時，審評員經常會要求申報人對此類氮氧化物形成的可能性進行考察，并要求評估其潛在基因毒性風險。而吡啶及吡啶類基團本身是缺電子基團，是一種弱親核試劑，而形成吡啶氮氧化物的絕大部分過程是親核氧化過程，所以作為降解物，吡啶及吡啶類的氮氧化物一般不易在制劑產品特別是固體制劑產品中形成。
（ 三） 屬于關注隊列（cohort ofconcern）的警示結構
黃曲霉素類、N- 亞硝基和烷基偶氮氧化物這3 類雜質，經過代謝激活后基因毒性非常強，因此是需要研究者高度關注的3 類化合物，結構通式見圖9。黃曲霉素通常在肝藥酶的作用下，二氫呋喃環的C=C 形成非常活潑的環氧環，遇到肝細胞DNA 會導致DNA 烷基化。黃曲霉中毒性最強的是黃曲霉素B1（圖10）[9]，如果攝入黃曲霉素超過一定限量，很容易引發肝癌。
3、基因毒性雜質的風險評估
國家藥品監督管理局（NMPA） 在2020 年5 月發布了《化學藥物中亞硝胺類雜質研究技術指導原則（試行）》[6] 指導綱領，特別提到了“風險評估方法可以采用ICH Q9（《質量風險管理》）中所述的FMEA（Failure Mode Effects Analysis）或FMECA（Failure Mode，Effects and Criticality Analysis）， 或其他科學合理的方法”。但在實際操作中，FMEA 和FMECA 這2 種模式在使用和應用上，特別是對是否存在亞硝胺類雜質進行的風險評估較為繁瑣。
在實際操作中，對于原料藥的風險評估，一般從幾方面入手：①要從理論分析，分析其制造工藝是否有存在或產生基因毒性雜質的可能性（包括工藝雜質與降解雜質）。②要看基因毒性雜質產生的可能性及其殘留可能性的大小。③要看基因毒性雜質的產生點到成品化學原料藥（API）之間有幾個步驟，如分離或純化步驟，評估其去除率（purging factor）。
在過去的基因毒性評估中，風險評估控制點通常是評估起始物料、中間體、試劑、溶劑本身是否具有警示結構，以及評估其在反應中形成基因毒性雜質的可能性。2018 年7 月“纈沙坦事件”，即從纈沙坦原料藥中檢出NDMA 以來，提示著我們還必須關注物料中的雜質或是降解雜質是否具有警示結構，以及其在反應中是否有形成警示結構的可能性，如在“纈沙坦事件”中部分原料藥工藝中使用二甲基甲酰胺（DMF）作為反應溶劑產生NDMA的機制（圖11）。
在我們的實踐中，形成了評估亞硝胺雜質風險行之有效的4 因素法（4 factoranalysis），即風險評估要關注以下4 個因素：①評估反應中是否用到仲胺。②評估反應中是否存在過亞硝酸（即亞硝酸鹽與酸性反應條件）。③評估仲胺與亞硝酸是否在同一個反應步驟。④評估亞硝胺類雜質的潛在產生點之后，有幾步分離或純化步驟（即去除率是多少）。
前3 個因素為導致亞硝胺產生的風險點，而第4 個因素是降低風險的去除率。如果前3 個評估結果都是“有”或“是”的話，那么這個工藝產生亞硝胺的風險很高，即使有多步分離或純化步驟，可能也無法完全控制住風險。相反，如果前3 個評估結果都是“無”或“否”的話，那么這個工藝產生亞硝胺的風險就很低或可忽略不計。從控制策略層面，首選的工藝最好能符合后者的情形，即以不產生亞硝胺類雜質的工藝為最佳、以去除純化為輔的策略。
對于上述4 個因素，需要關注相應的細節。如果仲胺本身不是試劑，而是試劑中的雜質，其風險由于含量比之試劑的用量降低而相應降低。這是因為仲胺與亞硝酸的反應是直接形成亞硝胺的二級反應，其反應速率與仲胺和亞硝酸的濃度成正比。同樣，叔胺的風險比仲胺低很多，因其反應形成亞硝胺需要多個步驟，故效率會降低很多。根據我們以三乙胺和二乙胺為模型在不同濃度范圍內進行的初步研究，三乙胺與亞硝酸形成N-亞硝基二乙胺（NDEA）的效率只是二乙胺的1/50~1/200。上述4 因素也可以量化，根據每一類工藝的特點，賦予4 個因素（F1、F2、F3、F4）以合理的數值，以前3 個因素為乘積，除以第4 個因素而得到每一個工藝量化后的風險值，即風險=F1×F2×F3 ∕ F4，數值越低，則風險越低。
對于制劑中基因毒性雜質的風險評估，重點在于判斷原料藥中的基因毒性雜質是工藝雜質還是降解雜質，包括原料藥與輔料相互作用形成的降解雜質[10]，以及輔料和包材中可能引入的基因毒性雜質。對于液體和半固體制劑，尤其需要關注主包材中可能引入的基因毒性雜質。
4、基因毒性雜質的控制策略
對于原料藥中亞硝胺類雜質的質量控制，需要注意避免高風險的反應、試劑、溶劑等，包括：①避免高風險的反應，如亞硝酸淬滅（在產品存在的情況下）、次氯酸鈉淬滅（在產品存在的情況下）、重氮化反應（sandmeyer reaction）等。②避免高風險的試劑，仲胺或含仲胺雜質的試劑（如二乙胺、三乙胺等）。③慎用高風險的溶劑，DMF、N- 甲基-2- 吡咯烷酮（NMP）。④避免在工藝后期步驟采用一鍋法，尤其是可能含有基因毒性或潛在基因毒性雜質的步驟。在充分理解基因毒性雜質產生的源頭、走向、去除率（以加標實驗估算去除率）的基礎上，制定合理的控制策略及指標。
對于制劑中基因毒性雜質的控制，如果是原料藥的工藝雜質，可在原料藥中制定適當的指標控制；如果是降解雜質，需要在穩定性和加速穩定性研究時加以關注。通常溫度和濕度會加速藥物的降解，而氧氣則會加速氧化降解雜質的產生；制劑產品的濕度和含氧量，可以通過選擇相關的包材、干燥劑和除氧劑加以控制。
5、基因毒性雜質的毒理學評估
如果化合物具有警示結構且沒有相關的毒理學研究數據，可以采用計算機軟件進行評估（in silico evaluation），即利用符合經濟合作與發展組織（Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD） 要求的定量結構活性關系(Q)SAR（Quantitative structure activity relationship） 模型對化合物在細菌回復突變試驗（Ames test）呈陽性的概率進行預測。ICH M7 指出“計算機毒理學應采用（定量）構- 效關系（Q）SAR 方法學進行毒性評估”“應采用兩種互補的（Q）SAR 預測方法。一種方法應基于專家知識規則，另一種方法應基于統計學”。常用的評估軟件有Derek/Sarah、Case Ultra（by MultiCase）、LeadScope、ACD/Labs 等。需要注意因為Derek 只是識別人類專家經驗規則定義的警示結構的模型軟件，而Sarah 只是基于統計學分析的（Q）SAR 模型的預測軟件，Derek 和Sarah 軟件需要同時使用。其他各家軟件中均同時包含了這2 個預測模型功能。
化合物的毒理學數據來源包括ICHM7 附錄、致癌性數據庫（Carcinogenicity Potency Database，CPDB， 已被整合到其他數據庫中）、歐盟化學品管理局（European Chemical Agency，ECHA）、國際癌癥研究署（International Agencyfor Research on Cancer，IARC） 分類、美國國家癌癥研究所/ 國家毒理學計劃（NCI/NTP） 以及其他公開發表的文獻來源等。CPDB 數據庫提供了1547 個化合物的半數致癌劑量（TD50），可根據TD50數據線性外推出AI。IARC 分類定義包括1 類：已知的人類致癌物（已證實的致癌物或對人體有一定致癌作用的化合物）；2A 類：可能致癌物（充分的動物致癌性研究數據，但人類致癌性研究數據有限）；2B 類：可能致癌物（有限的人類致癌性研究數據，不充分的動物致癌性研究數據）；3 類：對于人類的致癌性，無法歸類的物質（不充分的人類和動物致癌性研究數據）；4 類：不可歸類為人類致癌物（充分的人類非致癌性研究數據）。
（一）數據庫未更新數據的問題
常見的基因毒性雜質有磺酸酯、硫酸酯、苯胺類化合物、硝基化合物、氨基甲酸乙酯等。在實際審評時，可能會遇到一些特殊情況，如氨基甲酸乙酯在CPDB 數據庫里的限度值遠高于FDA 和EMA 采用的限度值，歸其原因可能是數據庫里的數據未及時更新。而監管部門在審核時，有的機構本身會有原研數據，因此對類似的引用數據庫中未更新的數據，可能會不予接受。
（二）基于基團親電性的經驗規則
1. 含醛基化合物的鄰位效應
一些簡單的含醛基化合物產生基因毒性的可能性比較小，而在醛基鄰位含有吸電子基團的醛基化合物，其基因毒性的可能性增大。歸其原因是鄰位吸電子基團使得醛基化合物的親電性變強，而這類化合物在反相高效液相色譜（RPHPLC）的分析中很可能以水合物的形式存在，這是醛基被活化的直接證據。另外，一些雙醛基化合物可能由于2 個醛基的協同效應而產生基因毒性。一些此類案例如圖12 所示，戊醛Ames 為陰性，而戊二醛Ames 為陽性；苯甲醛Ames為陰性，而2,4- 二硝基苯甲醛和2,6- 二硝基苯甲醛Ames 為陽性。
2. 含鹵素烷基化合物
簡單的含氯烷基化合物（即不與一些其他官能團相連接，如芐基、烯丙基等激活基團）是基因毒性雜質的可能性比較小或其基因毒性很弱，屬于后者的化合物的AI 比常規雜質的限度高很多。可根據其親電化學反應活性進行判斷，如氯乙烷AI 為1810 μg/d、氯甲烷 AI 為1361 μg/d，二者都是很弱的親電試劑。而簡單的含溴烷基化合物是基因毒性雜質的可能性比同類含氯烷基化合物大很多，如溴乙烷的AI 為149 μg/d ；歸其原因可能是其親電性增加所致。
（三）警示結構雜質在食品中的廣泛存在——美拉德反應（Maillardreaction）
美拉德反應在食品化學中具有重要意義，如制備蛋糕或烤面包時的色澤或香味，是由于在反應中產生了很多微量含酮或醛基的物質所產生的。這類物質很多具有警示結構，尤其是其中的α- 羰基類化合物。美拉德反應的示意圖見圖13。
（四） Ames 試驗
評估一個化合物是否為基因毒性雜質的Ames 試驗，按照目前OECD 的標準， 通常采用5 個菌株（Salmonella typhimurium TA1535 ；TA1537 或TA97或TA97a ；TA98 ；TA100 ；E. Coli WP2uvrA 或E.coliWP2 uvrA/PKM101 或Salmonella typhimurium TA102） 進行檢測，其中4 個為鼠傷寒沙門菌突變株，1 個為大腸桿菌突變株。而在實際審評中，如果參照的是比較老舊的文獻資料，沒有同時在上述5個菌株中做相關試驗，即使Ames 檢測結果為陰性，監管部門在審核時也可能會不予接受。
（五）亞硝胺類雜質TD50 數值與合理限度的制定問題
自“亞硝胺類事件”出現之后，從長遠角度考慮，各研發機構均需采取有效的措施及制定合理的控制策略，以避免工藝中產生亞硝胺類雜質。各國監管部門對于亞硝胺類基因毒性雜質的控制策略有所不同，FDA 和EMA 在事件初期發布了亞硝胺類雜質臨時限度（Interimlimits）[3]。隨后，EMA 要求在2 年內對所有藥物進行亞硝胺風險評估[11-13] ；FDA 要求在其2020 年9 月發布《人用藥物中亞硝胺雜質控制》（Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs）指南后6 個月內，對已批準和上市的藥物進行亞硝胺風險評估[4] ；NMPA 發布了《化學藥物中亞硝胺類雜質研究技術指導原則（試行）》[6]。隨著對亞硝胺類雜質認知的不斷深入，監管部門接受在對亞硝胺類化合物進行充分風險評估的基礎上，對致癌性研究數據充分的亞硝胺類化合物，可以采用TD50 進行線性外推得到其（終身）可接受攝入限度（acceptable intake limits）， 如NDMA（AI = 96 ng/d）和NDEA（AI = 26.5 ng/d） 的可接受攝入量限度是根據其TD50 推算的（表1）[4-5]。而對于致癌性研究不充分的亞硝胺類化合物[ 如N- 亞硝基二丁胺（NDBA）、N-亞硝基-N- 甲基-4- 氨基丁酸（NMBA）和N- 亞硝基二異丙胺（NDIPA）]， 即使其有TD50 值也不能直接采用，仍需要通過構效關系（SAR）分析制定合理限度；如NMBA 的可接受攝入量可以根據NDMA 的TD50 進行推算，NDBA 和NDIPA 的可接受攝入量可以根據NDEA的TD50 進行推算。對于致癌性數據未知的亞硝胺類化合物，EMA 推薦采用安全工作組（safety working party，SWP）的特定類別化合物的TTC 18 ng/d 作為保守限度；而對于結構類似的亞硝胺類化合物，也可以通過SAR 分析制定合理限度，如N- 亞硝基乙基異丙胺（NEIPA）的可接受攝入量可以根據NDEA 的TD50進行推算[5]。
6、基因毒性雜質的分析方法
基因毒性雜質分析方法的開發和選擇不同于其他普通雜質分析方法，在靈敏度、選擇性、待測物穩定性、基質復雜性等方面有其特殊要求。一般來說，基因毒性雜質的分析方法主要有限度方法和定量方法。如果原料藥中的基因毒性雜質在至少6 個連續的中試批次或者3 個連續的生產批次中，測得結果均低于可接受標準的30%，則可以進行論述并定期檢測，以后每年抽檢3 批即可；如果不滿足該條件，則需要對原料藥進行常規批批檢測。
（一）根據基因毒性雜質的限度和結構，開發合適的分析方法
基因毒性雜質檢測通常采用的方法有：高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜- 質譜聯用（LC-MS）、液相色譜- 質譜/ 質譜聯用（LC-MS/MS）、液相色譜- 高分辨質譜聯用（LC-HRMS）、氣相色譜法（GC）、氣相色譜- 質譜聯用（GC-MS）、氣相色譜-質譜/ 質譜聯用（GC-MS/MS，直接進樣與頂空進樣）、離子色譜法（IC）等。對于不同性質的基因毒性雜質，采取不同的方法：
揮發性雜質：采用GC、GC-MS 和GC-MS/MS 等檢測方法。通常雜質限度在100 ppm 以上，可以直接采用GC 方法[ 氫火焰離子化檢測器（FID）或電子捕獲檢測器（ECD）] ；若雜質限度在1~100 ppm，可以采用GC-MS 方法，通常采用電子電離（electron Ionization，EI） 模式；若雜質的限度低于1 ppm，推薦使用GCMS/MS 方法，以獲取更好的靈敏度和專屬性。
GC 方法需要考慮使用何種進樣模式。頂空進樣：適用于揮發性大的組分分析，可以減少樣品的前處理步驟，減少樣品分解對于目標雜質的干擾影響，優點是基質干擾小、進樣重復性好；缺點在于由于雜質的分配系數原因導致基質對定量準確性可能產生一些影響。直接進樣：適用于多數熱穩定性好的組分分析，優點是能夠在進樣口氣化的化合物，進樣方式簡單方便；缺點在于進樣重復性差，并且由于大量樣品進入進樣口，長期檢測會導致儀器污染的可能性大大增加。若樣品制備時采用液液萃取（liquid-liquidextraction）的方法或采用 基質沉淀法，即先將樣品溶解在良溶劑中，再用不良溶劑使樣品析出，目標雜質仍處于溶液中，此法不但能提高方法的靈敏度，也可以減少樣品對儀器的污染。
GC-MS 用于基因毒性雜質檢測時，由于存在基質干擾，可能有共流出物質的碎片或者同位素峰剛好與目標雜質的表觀質荷比（m/z）相同，這樣就會導致檢測結果的假陽性，特別是采集的m/z 較低的物質這種現象尤為突出。采用GC-MS/MS 可以降低假陽性的發生率，并可進一步通過觀察樣品與對照品檢測的定性離子和定量離子的比例是否一致來幫助判斷是否有假陽性。當出現假陽性時，需要通過優化GC 參數（進樣口溫度、柱溫、色譜柱）將共流出物和目標雜質達到基線分離來解決假陽性，也可通過加入內標物（目標雜質的氘代物）進行校正。
非揮發性雜質：采用HPLC、LC-MS、LC-MS/MS 等檢測方法。通常雜質的限度在100 ppm 以上，可以直接采用HPLC方法（取決于紫外或熒光發色團的強弱）。若雜質限度在1~100 ppm， 可以采用LC-MS 方法，通常采用ESI 正離子模式；但根據離子化基團的特性，ESI 負離子可能在某些情況下更合適；對于難離子化的化合物，通常采用APCI。若雜質的限度低于1 ppm，推薦使用LC-MS/MS 方法，以獲取更好的靈敏度和專屬性。同時，LC-MS/MS 方法可降低基質干擾造成的假陰性（離子抑制）和假陽性（共流出物或同位素干擾）；對于無機陰離子和陽離子（如疊氮酸、亞硝酸、溴離子等）和有機離子（如生物胺、有機酸、糖類分析等）則可以采用IC 方法來檢測。
（二）基因毒性雜質分析方法開發的難點
基因毒性雜質分析方法開發的難點在于樣品基質對雜質的影響、雜質離子化效率、方法參數的選擇等。
方法參數的選擇：合理選擇流動相（乙腈或甲醇），以確保目標雜質有合適的保留時間（k’），而不至于太靠近死體積，以避免可能受到的干擾。同時，有機相的類型和比例對離子化效率有較大影響。在質譜多反應監測（MRM）定量離子和定性離子的選擇上，應選擇豐度較高、受干擾較小的離子，減少同位素峰和共流出物的干擾，同時要考慮樣品基質對離子選擇的影響。
靈敏度的優化：在適合的儀器和與化合物性質匹配的離子源基礎上，優化色譜和質譜參數；從化合物的結構入手，選擇合適的稀釋液和流動相，確保化合物能高效地離子化提高離子化效率；設計正交試驗對于離子源的參數進行優化。同時，將儀器保持在最佳狀態也是確保高效、穩定離子化的有效手段，否則，系統的殘留或者污染既會對某些目標雜質產生吸附或者離子抑制作用，降低方法的靈敏度和重現性，也可能在有些場合導致假陽性結果。
對于一些質譜響應較弱的雜質，必要時也可采用衍生法，簡單列舉如下。
LC-MS 衍生：目的是引入易離子化基團（如2- 巰基吡啶、吡啶等）。鹵代烷烴或含鹵代烷基的雜質可以采用2- 巰基吡啶衍生；對于某些此類雜質，也可以用吡啶本身來衍生。前者引入的吡啶基團在酸性條件下，容易形成正離子；而吡啶直接衍生鹵代烷基化合物所形成的N- 烷基吡啶正離子，在任何pH 范圍內均為正離子，其質譜響應非常高，可明顯提高檢測方法的靈敏度。
GC-MS 衍生：目的是引入衍生基團使雜質變得更容易揮發，如全氟苯基類衍生試劑五氟溴芐（PFBBr）、五氟苯酚、五氟苯硫酚和碘化鉀/ 碘化鈉等。五氟溴芐可以衍生羧酸、酚類和磺胺類雜質；五氟苯酚、五氟苯硫酚可以衍生硫酸酯或鹵代烴類雜質；碘化鉀/ 碘化鈉可以衍生磺酸酯類雜質，形成相應的碘代烷烴。這些衍生產物在GC-MS 上的響應均有明顯提高，通常能解決方法靈敏度的問題。
7、基因毒性雜質的研究、排查與控制基本流程
基因毒性雜質的研究、排查與控制基本流程見圖14。有些案例可能需要結合文獻和計算機軟件評估的結果做出綜合判斷。
8、新挑戰及未來趨勢
目前，制藥行業和監管部門對基因毒性雜質還在不斷的認知。這一點在FDA發布的相應公告中也有指出[1]，其具體表現為亞硝胺類雜質在其他類型藥物中不斷被發現，如2019 年下半年發現雷尼替丁和尼扎替丁中有超出可接受限度的NDMA[14]。根據目前已知的信息判斷，NDMA 是雷尼替丁和尼扎替丁的降解物。2016 年，美國的一項研究報道[15] 發現NDMA 也是雷尼替丁的代謝物。從雷尼替丁和尼扎替丁的結構判斷（圖15），這2個藥物本身就具備了形成NDMA 降解物或代謝物的條件。結構中的硝基在熱分解條件下可能重排成亞硝酸酯，進而有可能繼續分解成亞硝酸，這樣每分解1 個雷尼替丁和尼扎替丁分子就可能產生1 分子的亞硝酸，后者可以跟雷尼替丁和尼扎替丁結構中的二甲基胺基團發生反應而最終形成NDMA。從這個可能的機制看，其他替丁類藥物如法莫替丁（圖15），因為其結構中既沒有硝基，也沒有二甲基胺結構，因此不會形成NDMA。從臨床角度看，可替代雷尼替丁和尼扎替丁的藥物很多，除了其他替丁類藥物，還有質子泵抑制劑類藥物。
2019 年末在二甲雙胍的部分緩釋制劑中也發現了超出可接受限度的NDMA[16]，二甲雙胍目前沒有同類替代藥物。從目前得到的信息看，二甲雙胍原料藥和普通制劑中尚未發現有超標的NDMA，但是緩釋制劑中存在降解雜質NDMA 的問題。根據我們的初步研究發現，NDMA 可能是二甲雙胍的氧化降解雜質，用過氧化氫對二甲雙胍溶液進行強降解，可隨時間的不斷增加而產生NDMA。
基因毒性雜質的風險評估、排查與控制，是一項跨部門、跨學科且具有相當挑戰性的工作（圖16）。隨著我們對基因毒性雜質研究的不斷深入，我們對其了解也將不斷加深。監管部門對于基因毒性雜質限度的合理制定，也有著一個發展的過程。如在亞硝胺類雜質殘留事件的最初發生階段，FDA 的立場是亞硝胺類雜質不得存在（“Should be absent”）；在這種情形下，亞硝胺的實際控制限度由相應檢測方法的最低檢測限（LOD）所決定。對于NDMA和NDEA，FDA 發布方法的LOD 分別為5和1 ppb（相對于纈沙坦的每日最大劑量而言）。隨著事件的發生和發展，對于這2 個亞硝胺類雜質，FDA 現在接受由相應TD50 推算的AI， 分別為NDMA 96 ng/d和NDEA 26.5 ng/d（相當于在纈沙坦中的含量分別為300 和82.8 ppb）。另外，制定可接受限度（尤其是臨時可接受限度）的一個重要考量是如果受到影響的藥物召回，是否會造成這類藥物的短缺，以及短缺所造成的后果是否會更嚴重。
筆者認為目前毒理學評估，尤其是對于Ames 陰性的亞硝胺類雜質，如何充分地評估、制定合理的限度仍不明朗；未來基因毒性雜質的風險評估、排查與控制將是原料藥工藝開發的重中之重；基因毒性雜質分析方法的開發過程中，如何解決靈敏度、選擇性、假陽性和假陰性問題也將是持續的挑戰。
來源：中國食品藥品監管雜志
