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嘉峪檢測網 2021-05-19 08:49
摘要：目前，世界各國都在積極應對新冠肺炎疫情（COVID-19）所帶來的影響。新冠疫苗的研發與生產，已成為各國科研院所和醫療企業關注的焦點。同液體疫苗相比，凍干疫苗的運輸和儲存較容易，為解決疫苗冷鏈運輸難題提供了一種可行方案。真空冷凍干燥技術作為凍干疫苗生產中的關鍵一環，對疫苗的安全性和有效性起著至關重要的作用。本文首先介紹了冷凍干燥的基本原理和凍干機的主要結構，隨后闡述了疫苗的凍干工藝及凍干疫苗的優缺點，并進一步討論了影響凍干疫苗質量的主要因素（包括保護劑的選擇和凍干參數的設計）。
在全世界積極應對新冠肺炎病毒（COVID-19）的今天，疫苗的研發與生產已成為各國科研機構和醫療企業關注的焦點[1]。截至目前，全球處于研發階段的新冠疫苗已達百余種[2]；中國國產新冠疫苗已于2020 年9 月亮相中國（北京）國際服務貿易交易會[3]；并先后在阿聯酋、巴林、埃及、秘魯等十多個國家和地區合作開展國際臨床三期試驗[4 ]，接種人數已達數十萬人[5 ]，疫苗研發水平居世界前列[6]。
直接采用液體形式封裝的新冠疫苗，往往需要全程進行冷鏈運輸（溫度一般是在-20℃~-80℃之間），這為新冠疫苗的儲存、分發及接種帶來不小的挑戰[7]。同液體疫苗相比，凍干疫苗在正常冷藏溫度下（2℃~8℃）即可保持穩定，熱穩定性好，有效期長，運輸和儲存較容易，這為解決疫苗冷鏈運輸難題提供了一種可行方案[8 ]。凍干疫苗，顧名思義，就是利用真空凍干機，將疫苗制劑干燥后得到的保持免疫原性的干粉。疫苗接種前，一般先用稀釋液將疫苗干粉稀釋至一定倍數后再使用[9]。目前，凍干型新冠疫苗的研發日益受到世界各國的關注與重視：俄羅斯加馬列亞研究中心已經宣布研發出了抗新冠病毒的凍干疫苗[10]；美國輝瑞公司亦宣稱正在加緊開發新冠疫苗的凍干制劑，并預計將于2022 年一季度上市[11]。我國幅員遼闊，地形復雜，氣候多樣，加速研發具有自主知識產權的凍干型新冠疫苗，對于實現新冠疫苗的大規模遠距離運輸，以及保障偏遠地區人民群眾的生命健康，具有十分重要的意義。真空冷凍干燥技術（簡稱凍干技術），作為凍干疫苗生產中的關鍵一環，對疫苗的有效性起著至關重要的作用[12 ]。本文從真空冷凍干燥技術的角度出發，淺析了其在疫苗研發與生產中的應用，以期為新冠凍干疫苗的研制提供些許助力。
1 疫苗的凍干工藝
1.1 凍干的基本原理
水有三相（即固態、液態和氣態），根據熱力學相關理論可知，降低壓力可使水的沸點和冰點重合（如圖1 所示）。再通過加熱的方式，冰就可以不經液態而直接升華為氣態[ 13]。凍干的基本原理就是利用低溫低壓下水的三態變化，先將需干燥的物料降溫凍結，使物料中液態的水變成固態的冰[14]，然后在真空條件下對物料進行加熱，使冰直接升華成水蒸氣而除去，從而獲得低溫脫水的干燥制品[15]。一個典型的冷凍干燥工藝，其主要過程可分為恒壓降溫（圖1“a-b 階段”）、恒溫降壓（圖1“b-c 階段”）、恒壓升溫（圖1“c-d 階段”）這三個典型熱力過程。
1.2 凍干機的基本結構
疫苗的凍干離不開凍干機。凍干機主要由干燥箱體、制冷系統、加熱系統、真空系統、控制系統等組成[16]，一個經典的凍干機結構如圖2 所示。在保證制品質量的前提下，選用合適的凍干機，可以實現經濟效益和實用效果的雙贏[17]。
1.3 疫苗的凍干步驟
疫苗的凍干工藝可基本概括為：預凍、升華干燥（又稱第一階段干燥）、解析干燥（又稱第二階段干燥）和包裝四步驟：
（1）預凍階段：預凍是將疫苗藥液的溫度迅速降低至其共晶點之下，從而在低溫環境下將藥液凍結成固體，目的是保護疫苗的理化性能和生物學性能，并為接下來的升華干燥做好準備[18]。共晶點就是其內部不同成分同時析出固體結晶時的混合物的溫度，不同制劑的共晶點各不相同。一般來說，預凍階段要在1~3 小時完成[19]，并且其凍結溫度要比共晶點溫度低5~10℃[本文由藥研公眾號整理排版]。
（2）升華干燥（第一階段干燥）：升華干燥是在抽真空的狀態下，對疫苗制劑中的冰通過升華的方式來移除，是冷凍干燥的主要過程。升華干燥先是個恒溫減壓過程，而后在維持真空的條件下，通過加熱使冰升華逸出，是個恒壓升溫過程[20]。整個升華過程中，不允許冰出現熔化，否則會造成凍干失敗。
（3）解析干燥（第二階段干燥）：升華干燥完成后，藥劑內所有的冰已逸出，但還留有未凍結的殘余水分。為保證疫苗凍干制劑在存儲期間的穩定性，解析干燥就是要把殘余水分進一步降低，得到最終的疫苗干粉[ 21]。由于需要更高的能量才能去除結合水，因此解析干燥也是一個恒壓升溫過程。
（4）包裝：疫苗在凍干箱內凍干后，一般需要進行真空或充氮密封，以防止疫苗凍干制劑被污染及回潮。真空封口應在成品檢定中測定真空度；充氮封口應充足氮量，氮氣標示純度應不低于99.99%。由于膠塞和瓶口之間有漏氣，真空壓塞的樣品，水分往往會隨著藥品的存放（尤其是低溫存放）而上升。充氣壓塞的藥品瓶，內外壓力基本平衡，更適合長時間的存放[22]。
1.4 凍干疫苗的優缺點
凍干疫苗的優點是[23，24]：
（1）疫苗制劑在預凍前完成分裝，從而保證了劑量的精確性；
（2）由于凍干是在真空和低溫狀態下完成的，因此不易發生氧化和熱變性，可以最大限度地保持疫苗的理化性質和生物特性；
（3）固態的冰晶升華成為水蒸氣后形成的疏松多孔（海綿狀）結構，使凍干疫苗具有極好的速溶性和復水性，可迅速吸水溶解，恢復其原有特性；
（4）凍干疫苗易進行無菌化操作，污染相對減少，臨床應用效果好，過敏等副作用少；
（5）凍干疫苗脫水徹底，含水量低，重量輕，適合長途運輸及長期保存。凍干疫苗的缺點是[25]：設備投資大，維護費用高；干燥速率低，時間長，能耗大，因而凍干疫苗的成本較高。
1.5 常見凍干疫苗
由于凍干疫苗有著明顯的優點，因此越來越多的疫苗采用凍干劑型。2020 年7 月2 日，國家藥品監督管理局、國家衛生健康委員會發布公告，正式頒布2020 年版《中華人民共和國藥典》。
在新版《中國藥典（三部）》中，共記錄有21 種凍干疫苗（含口服型和注射型）[26]，作者現將這些疫苗篩選出來并列于表1，以供讀者參考。
2 影響凍干疫苗質量的因素
一般來說，影響疫苗質量的因素，主要是保護劑的選擇和凍干參數的設計。
2.1 保護劑的選擇
疫苗制品在整個凍干過程中存在的各種應力，包括凍結應力、低溫應力、干燥應力等，這些應力在一定程度上會導致疫苗發生變性。為了減少疫苗在凍干過程中的損傷，需要在凍干前加入合適的保護劑，以盡可能地保護疫苗的穩定性和免疫原性。在疫苗中常見的保護劑，主要有糖、醇、氨基酸、聚合物、無機鹽、蛋白質、表面活性劑等。這些保護劑在冷凍階段發揮保護作用的為冷凍保護劑，而在干燥階段發揮保護作用的為凍干保護劑。常見的各種保護劑如表2 所示。
2.1.1 糖類
糖是凍干疫苗中最普遍的一類保護劑，是蛋白質的非特異性穩定劑。疫苗的蛋白質分子中存在大量的氫鍵，水分子通過氫鍵和蛋白質分子相連接。在凍干過程中，糖類代替水分子，通過氫鍵與蛋白質上的親水基團相結合。糖的保護作用與糖的種類、含量以及蛋白質的種類等有關[ 27]。在糖類中，蔗糖和海藻糖是目前公認的最有效的保護劑[ 28][本文由藥研公眾號整理排版]。
2.1.2 醇類
醇類也是一類常見的保護劑，其保護機理與糖類相似：醇類的羥基能替代蛋白質表面水分子的羥基，從而在蛋白質表面形成一層假定的水化膜，穩定了蛋白質的結構，防止蛋白質在凍干過程中發生變性[28-30]。
2.1.3 氨基酸
在冷凍過程中，氨基酸作為保護劑，其主要作用是提升制品的塌陷溫度，防止因塌陷而破壞蛋白質的結構[28-30]。
2.1.4 聚合物
聚合物作為大分子保護劑，要與小分子保護劑（如糖類、醇類等）聯合使用。由于聚合物的相對分子質量較高，能夠提高產品的玻璃化轉變溫度Tg'，從而保證了冷凍干燥的順利進行；此外聚合物黏度一般較大，能夠阻止蛋白質間相互作用造成的變性[ 28，31]。
2.1.5 蛋白質
蛋白質類保護劑根據來源可分為兩種：動物源性蛋白質和外來蛋白質。人血清白蛋白是一種優良的蛋白質穩定劑，能有效阻止蛋白質表面的吸附，對凍干過程中的多數蛋白都能起到保護作用[ 28，30]。
2.1.6 緩沖劑
許多病毒的蛋白質結構耐受的pH 值范圍比較窄。因此，在制品中加入適當的pH 緩沖劑尤為必要。在實際使用中，應根據病毒或蛋白質特性及適合的pH 范圍來確定緩沖劑[ 31]。
2.1.7 抗氧化劑
抗氧化劑是有著自由基清除功能的化合物，也是一種還原劑?？寡趸瘎┠軌蛳难趸蛞种蒲趸钚裕乐箖龈梢呙缭谫A存期間變質失活[ 29，31]。
2.1.8 表面活性劑
在冷凍階段形成冰- 水界面會吸附蛋白質，這會破壞蛋白質的天然褶皺結構并導致其變性。加入表面活性劑可減少蛋白質的聚集，從而對蛋白質起到較好的保護作用[ 30，31]。
2.1.9 填充劑
填充劑既可防止活性組分隨著水蒸氣一同升華逸散，又可為凍干產品提供機械支撐作用。如配方中含有填充劑，常常需要在預凍階段增加退火步驟以保證結晶完全[ 31]。
事實上，單獨一種保護劑對疫苗的保護作用有限，為了使上述各類保護劑發揮其各自的作用，通常是采用兩種以上的保護劑按照比例配制后使用[32]。對于不同的疫苗，其理化性質不同，因此所使用的保護劑配方也不同。篩選配方是疫苗研發中的重要一環，這通常需要進行大量的試驗，從而獲得復溶速率快，性能良好，質量穩定，成本較低的凍干疫苗配方。另外，配方里的固體含量會影響預凍以及干燥階段。若固體含量小于2%，凍干結構的機械性能則會不穩定，由于缺少骨架支撐，產品外觀可能會塌陷；并造成干燥過程中不能被粘在基質上的制品微粒，被逸出的水蒸氣帶到容器的塞子上，甚至會被帶入真空室中造成污染。如果固體含量太多，不僅會影響配制時的溶解性及凍干后的復溶性，還會增加生產成本。因此，為獲得均一穩定的凍干疫苗，需要將配方中的固體物質含量控制在合適范圍內[33]。
2.2 凍干參數的設計
2.2.1 預凍階段的影響因素
預凍階段十分重要，在凍結中形成的冰晶形態和大小不僅會影響后續的干燥速率，還會影響凍干疫苗的質量和復溶時間。影響預凍過程的因素主要有凍結方式、凍結速率、凍結溫度、凍結時間以及是否退火等。對上述參數進行試驗，可得到產品最佳的凍結速度、升華速度以及溶解速度。
2.2.1.1 凍結方式的影響
凍結方式可分為全域過冷結晶與定向結晶兩類。不同的凍結方式會產生不同的冰晶形態和大小，亦會影響到制劑的干燥速率和凍干質量，所以運用好凍結方式顯得尤為重要。全域過冷結晶是指全部溶液處于相近或相同的過冷溫度下進行凍結的方式，按凍結速率的快慢可分為慢速凍結（每分鐘降溫1℃）和快速凍結（每分鐘降溫10~15℃）兩種。在全域過冷結晶中，冰晶成核溫度和凍結速率是重要的參數。定向結晶是指一小部分溶液在過冷狀態下進行凍結的方式。通常，采取定向結晶方式凍結的藥液其干燥速率比全域過冷結晶的快。但無論采取哪種凍結方式，藥液必須確保部分或全部實現玻璃化凍結，以保證其藥性[34-37]。
2.2.1.2 凍結速率的影響
凍結速率的快慢對凍結出的晶粒大小和升華速率等均有直接的影響[ 38]。慢速凍結的冰晶較大，產品外觀粗糙，存在凍結濃縮現象；其內部蒸氣逸出通道尺寸較大，故升華速率快，但解析速率慢。快速凍結的冰晶較小，且沒有凍結濃縮現象，加水復原時溶解快；但是升華阻力較大，存在不完全凍結現象，故升華速率慢[ 34-36 ]。
2.2.1.3 凍結溫度的影響
凍結溫度根據預凍方法及樣品性質的不同而有所差異。一般來說，凍結溫度與藥液的共晶點有關，安全的凍結溫度應低于其共晶點10℃左右。若凍結溫度太低，則會浪費能源[ 34，35]。
2.2.1.4 凍結時間的影響
設置一個恰當的凍結時間可以保證藥液在干燥之前被凍牢，以免因為抽真空而發生噴瓶。凍結時間根據板層面積、樣品數量、傳熱介質的性質而定，一般在1~3h 內完全凍結[34-36]。
2.2.1.5 退火的影響
退火是把凍結疫苗升溫接近其共熔點并保溫一段時間，然后再降溫到凍結溫度的處理過程。在升華前增加退火工藝的原因主要是：①由于退火溫度高于凍結樣品的玻璃化轉變溫度Tg'，這會促進溶液中的結晶成分與濃縮液中未凍結的水結晶完全，從而強化結晶；②提高非晶相的最大凍結濃縮液的玻璃化轉變溫度Tg'，從而提高穩定性；③退火過程中的相行為與重結晶，可以降低因成核溫度差異所導致的冰晶尺寸差異，調整冰晶形態以及大小分布，提高干燥效率。為了實現退火工藝的目的，在操作中須注意加熱速率，退火溫度和退火時間等工藝參數。由于目前對凍干中的退火機理的認識尚處于起步階段，因此退火工藝參數的選取缺乏有效的依據[ 34-37 ]。
2.2.2 升華干燥階段的影響因素
升華干燥是整個凍干過程中耗時最長的步驟，同時也是最復雜的步驟。其工藝受到溫度、壓力以及產品本身性質等參數的影響。升華干燥的理想狀態是在保證疫苗質量的前提下，盡可能地提高升華速率，縮短升華時間，降低能耗。
2.2.2.1 升華溫度的影響
升華溫度既不能超過已干層的崩解溫度，也不能超過凍結層的共熔點溫度。升華溫度如果遠低于共熔點溫度，則升華速率會明顯降低，升華時間會顯著延長；如果高于共熔點溫度，則物料會發生熔化，干燥后的物料可能發生溶解困難，顏色加深等現象。因此升華階段物料的溫度要盡量接近但又不超過共熔點溫度；越接近共熔點，升華速率越快。在升華干燥階段，凍干箱的擱板是物料熱量的來源，主要靠下擱板的熱傳導和上擱板的熱輻射兩種方式提供熱量。因此擱板溫度應控制在合理的范圍內，一般根據升華溫度、凍干箱內的壓強以及冷阱溫度三個因素來確定[ 34-36]。
2.2.2.2 箱內壓強的影響
箱內壓強過高時，藥品吸收的熱量會增加，藥品自身溫度會上升，當溫度高于共熔點溫度時，藥品會熔化導致凍干失敗；箱內壓強過低時，不利于傳熱，藥品升華速率反而會降低，亦會增加生產成本。一般來說，箱內壓強控制在10~30 Pa時，不僅有利于熱量的傳遞，還有助于升華的進行[35-39]。
2.2.2.3 冷阱溫度的影響
冷凍干燥中制品和冷阱間的溫差是水升華的驅動力，升華出的水分通過冷阱來捕集。由于藥品溫度受共熔點溫度等因素的限制，因此應盡可能降低冷阱溫度。一般來說，升華干燥過程中冷阱溫度至少應低于物料溫度20℃[34，37 ]。
2.2.2.4 升華速率的設計
升華速率直接影響凍干工藝的時間，其大小取決于提供給升華界面熱量以及從升華界面通過干燥層逸出水蒸氣的快慢。升華干燥過程中，若真空度不夠或供熱不足可能導致成品水分升華不完全，含水量偏高。過快的升華速度可能破壞已凍干層的結構；嚴重的會造成噴瓶，導致凍干失敗。冷凍干燥的最終目的是獲得均一合格的產品，因此升華速度的控制必須以此為標準。升華干燥的理想狀態是在保證藥品質量的前提下，盡可能地提高升華速率。提高升華速率的措施有：改變干燥室的壓力；盡可能提高升華溫度；減小已干層的厚度；提高已干層的導熱性；降低冷阱溫度等。一般來說，性能良好的冷凍干燥機的升華時間較短[ 34]。
2.2.3 解析干燥階段的影響因素
解析干燥階段常見的控制參數是物料溫度、箱內壓強、冷阱溫度以及干燥時間。該階段要除去產品內結合水，因此擱板需要提供足夠的熱量以克服水的結合力，將產品升溫到其最高許可溫度并維持幾小時直到凍干結束[39]。物料的最高許可溫度視物料的品種而定，一般控制在20~40℃[ 40 ]。若物料溫度超過其極限值，疫苗中的有效成分會變質，疫苗的免疫效果會降低。為了使結合水順利除去，凍干箱內應維持高真空，以使物料內外形成較大的蒸汽壓從而提高傳質效率[ 34 ]。此外，在解析干燥過程中應盡可能的降低冷阱溫度。升華干燥所需的時間由制品的水分殘留量決定，對于含有熱敏性成分的疫苗，為防止其中的成分變性或失去活性，高溫時間不宜過長。
綜上可知，凍干操作中每個階段的參數設計都直接關系著凍干疫苗的質量，且不同的疫苗產品也有不同的凍結和干燥特性，因此應在上述設計原理的基礎上，進一步開展個體研究，優化凍干曲線，提高干燥速率，降低能耗[ 41]。
3 結論與展望
凍干疫苗的研發與生產，關系到人民群眾的身體健康。凍干參數和保護劑配方的設計，對凍干疫苗的質量起著至關重要的作用。作者認為，基于已有凍干疫苗的生產工藝，并結合新冠疫苗自身的特點，可以加速摸索出適合新冠疫苗的凍干工藝路線。隨著我國對新冠疫苗研發的不斷深入，相信在不久的將來，具有自主知識產權的凍干型新冠疫苗也將相繼面世，從而更好地為人民健康提供保障。
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