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嘉峪檢測網 2021-06-02 12:00
問：當我運行方法并測量色譜柱塔板數時，我的色譜柱塔板數約8000。但是生產商的文獻中色譜柱塔板數為13000。您能解釋這個差異嗎？
答：色譜柱的塔板數不是固定的。對于給定的色譜柱，塔板數取決于流速，溶劑的粘度和分析物的分子量。儀器也可能會影響，但我們暫時將其忽略。
色譜柱生產商已經建立了標準化的條件，可以通過這些條件來檢查色譜柱的質量。在反相色譜中，通常使用簡單的疏水性分析物（例如甲苯，萘或苊）進行測量。檢查這些化合物使用的流動相含有大量的有機溶劑。因此它們具有低粘度。另一方面，大多數HPLC用戶正在處理更多極性化合物，這需要具有更高水含量的流動相。這些流動相具有較高的粘度。由于在正常HPLC條件下，隨著粘度的增加，塔板數會減少，因此在實際使用條件下，塔板數要比在柱測試條件下要低。
問：如果在正常使用條件下的塔板數低于生產商報告的塔板數，生產商是否會在色譜柱性能方面誤導用戶？
答：不是。這不是它的目的。生產商使用的色譜柱測試程序旨在檢查色譜柱的質量，并且最好在色譜柱的塔板數達到或接近最大值的情況下完成此操作。這是柱填充技術影響最大的地方。因此，如果我要檢查包裝技術的質量，這就是我要對其進行測量的地方。
問：請多解釋一些原因，為什么塔板數會隨著流速，塔填料等的變化而變化！
答：塔板數對各種參數依賴性的根本原因是減小的板高，以及它對減小的流速的依賴性。我將對此略作概述，但是為了更深入地了解，我們需要看一本有關色譜的教科書。
色譜柱的塔板數是色譜柱長度L除以降低的板高h和粒徑dp：
柱長和粒徑是固定的（已知）。減小的板高度取決于減小的速度，其定義如下：
這個方程包含線速度u，樣品在流動相中的擴散系數DM以及粒徑。大部分HPLC工作都是在降低的流度（在3到20之間）下進行的。
文獻中有幾個方程式描述了減小的塔板高度對減小的速度的依賴性。在此處討論的速度范圍內，它們給出相同的結果。因此，讓我使用最簡單的一個，它基于van-Deemter方程：
該系數是經驗值，并且已從廣泛的數據庫中獲得了反相操作條件的系數。通過這種關系描述的曲線具有最小值，它以約2.5的降低速度達到。第一系數是填充均勻性的量度。因此，這取決于包裝過程。
Thecolumnplatecountdependsonthereducedvelocityas follows:
色譜柱板塔數取決于降低的速度，如下所示：
因為HETP對速度的依賴性最小，所以塔板數對速度的依賴性最大。稍加演算就可以看出最大板數約為L / 2.3 dp。因此，我們可以得出結論，填充5µm顆粒的15 cm色譜柱的最大板數為13000，是一個很好的色譜柱。
不良的色譜柱填充對方程式3的第一個系數有很大的影響，而其他的則保持大致相同。當其他因素的影響最小時，此系數的影響最大。這就是為什么要在最大塔板數或接近最大板數的條件下測試色譜柱的原因。
現在讓我們解決您的問題的第二部分，塔板數對流量的依賴性。我通過降低速度來彌補這一點。首先，降低的速度與線速度成正比，線速度與流速成正比。因此，塔板數取決于流速。在非常低的流量下它是低的，而在高流量下它也是低的。最大塔板數介于兩者之間。但在哪里？從方程2中降低的速度的定義可以看出，降低的速度包括分析物在流動相中的擴散系數。從上面的結果我們知道，以2到3左右的速度降低出現最大塔板數。對于測試樣品中的疏水性分析物的色譜柱的流動相通常為70/30（v / v）乙腈/水，對于5µm的色譜柱，這意味著線速度為1至1.5 mm / sec。對于內徑為3.9mm的色譜柱，對應于該線速度的流速約為0.5至0.7ml/min。對于內徑為4.6mm的色譜柱，對應于該線速度的流速約為0.7至1 ml/min。
由于曲線最小值的點取決于擴散系數，因此我們需要知道擴散系數與流動相的關系。文獻中有一些方程式，這些方程式使我們能夠估計分析物在特定溶劑中的擴散系數（例如，Wilke-Chang方程式）。然而，對于當前的討論，我們只需要知道擴散系數與流動相的粘度成反比：
這意味著發生最大塔板數的速度（或流速）隨粘度的增加而降低。70/30（ v / v）乙腈/水的流動相的粘度為0.7 cP，而50/50（ v / v）甲醇/水的流動相的粘度為1.8 cP。當我們使用甲醇/水流動相時，對于裝有5 µm顆粒的3.9 mm色譜柱，最佳流速降低至0.2-0.3 ml/min，而對于4.6 mm色譜柱，則降低至0.3至0.45 ml/min。在方法開發過程中，這一點值得牢記。
有一個有趣的方面擴散系數對溶劑粘度有依賴性。改變流動相組成時，可以使用以下經驗法則來估算色譜柱性能：在不同的流動相中，相同的色譜柱在相同的背壓下將得到大約相同的塔板數。請記住一個有用的規則！
來源：Internet
