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本篇將系統介紹流式細胞儀究竟是什么，它的檢測原理及關鍵組成部件。

 

一、流式細胞儀概述

 

（一）定義

 

流式細胞儀（流式細胞術）是利用激光作為光源產生散射光和熒光信號，并將這些信號由光電二極管或光電倍增管等檢測器讀取、轉換為電子信號、標準化格式 (fcs) 等數據文件輸出，從而對溶液中的單個細胞進行快速篩選和分析或對特定的細胞亞群進行分析并進行分離純化的儀器。

 

 

圖 流式細胞儀簡圖1

 

用于流式細胞儀的樣本是單細胞懸液，可以是血液、懸浮細胞培養液、各種體液、新鮮實體瘤的單細胞懸液以及石蠟包埋組織的單細胞懸液等；

 

通過檢測可以對粒子進行多參數分析，包括諸如粒子形狀、大小、細胞周期、多藥耐藥蛋白、細胞內細胞因子、細菌表面抗原、細胞DNA內含物、多分子復合體排列等；

 

通過激光光源激發細胞上所標記的熒光物質的強度和顏色以及散射光的強度也可以得到細胞內部各種各樣的生物信息；

 

此外還可以利用高分子熒光微球在流式細胞儀上做免疫和聚合酶鏈反應等多種生物技術檢測；

 

流式細胞儀一般還有篩分的作用，可以根據所檢測細胞的某種性質進行分選，如果分選的過程是在無菌條件下進行的，那么這些細胞還可以用來進一步培養。2

 

（二）檢測原理

 

流式細胞儀的工作原理是使懸浮在液體中分散的經熒光標記的細胞或微粒逐個通過樣品池，同時由熒光探測器捕獲熒光信號并轉換成分別代表前向散射角、側向散射角和不同熒光強度的電脈沖信號（后文會詳細介紹），經計算機處理形成相應的點圖，直方圖和三維結構圖像進行分析（如圖）。

 

 

圖 流式細胞儀結構示意圖

 

在流式細胞儀中，溶液中的細胞以每秒10000個細胞（或更多）的速度通過儀器的激光束，進而對細胞進行檢測。如今的流式細胞儀具有更多的可檢測熒光參數（從1或2至最多30個左右或更多），可同時測量同一個細胞上的所有參數，其檢測速度快且具有單細胞水平檢測能力，可以為細胞生物學家在統計方面提供便利，快速分析和表征數百萬個細胞，但是流式細胞儀無法獲得顯微鏡可提供的形態特征和亞細胞定位，也造成了一些觀察上的不便，下表將流式細胞儀和顯微成像技術進行比較。

 

表. 流式細胞術與顯微成像技術對比

 

 

（三）結構組成3

 

流式細胞儀有3個主要組成部分，即液流系統、光學系統和電子系統，它們共同構成了完整的細胞分析系統（圖）。

 

 

圖 流式細胞儀的工作元件

 

 

圖 流式細胞儀結構簡圖

 

1、液流系統

流式細胞儀的液流系統包含鞘液（一種基于鹽的緩沖液或水），該鞘液被加壓通過機器，以引導細胞樣品通過激光，以便對每個單個細胞進行單獨測量。

一般來講在樣品進入流動池之前，細胞或微粒在流體懸浮液內以隨機和無組織的方式移動（圖A），按照它們在圓柱形液體柱中的運動來繪制相同大小細胞的分布圖發現，由于一些細胞將比正常情況移動得更快，另一些細胞會移動的更慢，因而其形狀將近似雙曲線（圖B）。

 

 

圖 流式細胞儀液流系統圖

 

此外，在任何給定時間，也不能保證細胞都單列移動。這會導致：(1)以不同速度行進的細胞將引起數據波動 (2)彼此過于接近的細胞導致重合事件（兩個細胞被同時進行分析，而非獨立地）的發生（圖左）。

 

 

圖 細胞重合事件的發生

 

流式細胞儀獲得的準確的數據依賴于能夠確保樣品中的所有微粒都被聚焦成單個細胞，并且它們在到達檢測點之前以相同的速度移動的流體系統。因此，流式細胞儀流體系統通過利用流體動力學來解決上述問題。也就是，系統使用液體（水）來強制細胞以相同的速度，并以單個細胞行進。在流體動力學（圖右）中，使用較快移動的鞘液（鹽水）來迫使樣品進入流體動力學核心，使得所有微粒沿同一軸線，以大致相同的速度行進。

2、光學系統

光學系統的組件協同運作，將不同波長的激光照射到細胞上，收集發射光子形式的數據（即側向和前向散射光以及激發態熒光團的發射光），并將這些光子轉換成電信號，導入電子系統。光學系統的元件包括激發光源、濾光片（用于引導光路）以及用于產生光電流的檢測系統。

⑴ 激發光源

細胞與激光發生相互作用的地方，稱為激光檢測點。在這里，細胞排成單列通過，而聚焦激發光穿過細胞流。在流式細胞儀中，最常見的激發光源稱為激光。激光具有一致性（具有同步、相同的波頻率）、單色性（具有單一波長）和高能性，這些特點可確保照射到細胞的光是具有特定波長的均一光線，常見激發光線如下表所示。

 

表 流式細胞術中的常見激光譜線

 

 

⑵ 共線與平行激光裝置4

在選擇實驗用的熒光基團時，對激發光源的了解至關重要。一般這些光源的配置主要有兩種裝置：共線激光裝置和平行激光裝置（如圖）。共線激光裝置的激光器共用同一條光路，細胞同時被多個激光器激發。平行裝置中的激光器在空間上是分離的，細胞通過檢測點時，一次暴露于一個激發光源。不管是共線激光裝置還是平行激光裝置，兩個的裝置不是相互排斥的，因為一個儀器可以同時具有平行和共線激光裝置。

 

 

圖. 流式細胞儀的共線與平行激光裝置

 

所以在選擇用共線激光裝置和平行激光裝置時可根據熒光基團的激發光（激發波長是用某種波長的光激發出熒光）和發射光（指某種光發射出來的熒光的波長）來判斷，例如當兩種熒光基團的發射波長相同但激發波長不同時可選擇平行激光裝置，當發射波長不同激發波長相同時可選擇共線激光裝置。

⑶ 濾光片引導光路5

用于引導光路（光子）的發射濾光片有許多種，每組濾光片可將特定波長的光引導至與其相匹配的檢測器，如圖。

 

 

圖. 流式細胞儀中濾光片的位置

 

♦ 波通（LP）濾光片允許特定波長以上的所有光通過。圖A的實例是LP 500濾光片，表示波長在500nm以上的所有光均可通過濾光片。

♦ 短波通（SP）濾光片允許低于特定波長的所有光通過。圖B的實例是SP 500濾光片，表示只有波長低于500nm的光可以通過濾光片。

♦ 帶通（BP）濾光片可被認為是LP和SP濾光片的交叉組合。只有特定波長范圍內的光可以通過濾光片。圖C的實例是一個525/30 BP濾光片，表示只有波長/光在525 nm以下30nm內可以通過濾光片，或者說是只有波長在495-555 nm范圍之間的光可以通過濾光片，其他所有光將被偏轉。

 

 

圖. 不同的濾光片

 

⑷ 檢測器6

檢測器捕獲由激發態熒光團和散射激光發射的光子將它們轉換成光電流，并傳遞到電子系統。流式細胞儀可使用多種類型的檢測器，最常見的類型是光電二極管和光電倍增管。

光電二極管：當光子撞擊光電二極管時，它會將檢測器的原子離子化，在二極管的耗竭區域內產生電子，并將其掃向正負電位，如圖。光電二極管價格便宜，但是靈敏度較低，它們對光電流的放大能力不如光電倍增管，通常用于負責處理最明亮的光或信號的通道，如前散射通道。

 

光電倍增管：當光子進入光電倍增管時，它們撞擊光電陰極并產生電子，這些電子從倍增電極移動到產生二次電子的倍增電極，使信號放大，如圖。光電倍增管對于低信號水平更敏感，可以使單個光子的能量放大數百萬倍，它們通常用于測量來自細胞的激發態熒光團的熒光以及側向散射信號。

 

 

圖. 流式細胞儀檢測器

 

3、電子系統

流式細胞儀的電子設備將檢測到的信號轉換為可以使用軟件進行分析的數字參數的過程，具體如下：

1.當細胞經過檢測點，激光擊中細胞產生的光子可以被光電倍增器(PMD)或光電二極管探測到，這些光子可以來自細胞的散射或是細胞熒光物質的熒光激發信號；

 

2.當光子進入探測器，光子被轉化為電子，信號被按比例增強。探測器以電流的形式輸出信號，此刻便是信號進入電子系統的時間點，從圖中可以看到光子在電子系統中傳輸的路徑簡圖；

 

3.電流信號從探測器輸出后進入信號放大器，信號被放大并被轉換為電壓脈沖，脈沖繼而通過模數轉換器（ADC）被轉換為數字信號；

 

4.數字信號被傳送到電腦存儲為數據以備分析。

 

 

圖. 光子在電子系統中的傳輸路徑

 

4、流式細胞儀的輸出7

流式細胞儀的三個主要輸出測量值是前向散射，側向散射和熒光信號，激光的可見光會反射出每個流通池，從而提供流通的尺寸和形狀特征。

前向散射（FSC）：是從正方向來的散射，沿著激光路徑每個單元將使光圍繞單元的側面彎曲，從而引起衍射而反射細胞的大小。FSC的強度反映了細胞的直徑，如圖。

 

 

圖. 前向散射

 

側面散射（SSC）：是指在90度激光束下測量的散射，細胞中的結構改變進入細胞的光波方向，導致特定的細胞結構（例如顆粒和細胞核）折射光，反映了細胞的粒度或復雜性。SSC越強，折射越大，則預期單元中的粒度就越大。

 

 

圖. 側向散射

 

熒光信號：是激光激發熒光團時發出的光。熒光團是在激發時可以吸收并重新發射光的分子，來自激光源的光子被熒光團的電子吸收，將其移動到更高的能量狀態。這些電子然后以光子的形式釋放能量以返回其基態。這些光子的波長受過程中分子相互作用損失的能量數量影響。每個熒光團具有其自己的發射光譜，該發射光譜可以與其他熒光團的發射光譜部分重疊。熒光團可以用于標記抗體，這些抗體又可以結合并因此檢測細胞上或細胞內的特定抗原，或者可以用作染料直接染色細胞。

 

 

圖. 熒光信號

 

參考文獻：

 

[1]Adan A, Alizada G, Kiraz Y, Baran Y, Nalbant A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 2017;37(2):163-176. doi:10.3109/07388551.2015.1128876

[2]楊蕊, 鄒明強. 流式細胞術的最新進展[J]. 分析測試學報, 2004, 023(006):124-128.

[3]來源Thermo Fisher官網

[4]資料來源：Thermo Fisher 官網

[5]資料來源：Thermo Fisher

[6]資料來源：Thermo Fisher 官網

[7]Adan A, Alizada G, Kiraz Y, Baran Y, Nalbant A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 2017;37(2):163-176. doi:10.3109/07388551.2015.1128876