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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2024-09-14 16:48
近年來，人們更加關(guān)注化妝品的安全性、溫和性及其對(duì)生物環(huán)境的影響，消費(fèi)者中“成分黨”也日漸壯大。2022年化妝品中熱門成分的調(diào)研結(jié)果顯示，氨基酸、玻尿酸等成分名列前茅。氨基酸可滲透皮膚，是蛋白質(zhì)的基本組成物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)水油平衡、抗皺、抗衰老、抗過敏、美白等功能，生物來源廣泛、毒性小、溫和、易降解，其 pH為5. 5~6. 5，與人體肌膚接近，對(duì)人體刺激小，敏感肌膚也可以使用，且與化妝品中其他成分有很好的相溶性，深受人們青睞。目前氨基酸主要用于潔面、保濕、洗浴等化妝品中，化妝品中氨基酸的檢測(cè)也越來越受重視。
氨基酸的測(cè)定方法主要有比色法、離子色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法、熒光探針法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。由于氨基酸本身沒有紫外吸收基團(tuán)，需要與衍生試劑反應(yīng)引入生色基團(tuán)，其衍生物因具有紫外吸收光譜特征而能夠被檢測(cè)。用于柱前衍生的試劑主要有異硫氰苯酯（PITC）、鄰苯二甲醛（OPA）、丹磺酰氯（DNSCI）、2，4-二硝基氟苯（DNFB）等?；瘖y品由保濕劑、乳化劑及其他有效成分組成，而氨基酸的含量較低，測(cè)定氨基酸時(shí)基質(zhì)干擾大，因此為了有效測(cè)定化妝品中氨基酸的含量，對(duì)氨基酸的提取提出了更高要求。開發(fā)穩(wěn)定、高效測(cè)定化妝品中氨基酸含量的方法尤為重要。
DNFB衍生技術(shù)與液相色譜法聯(lián)合耗時(shí)長，但價(jià)格低、對(duì)色譜柱損害小、衍生物穩(wěn)定，可用于氨基酸的測(cè)定，目前主要應(yīng)用在食品氨基酸的測(cè)定中，而在化妝品氨基酸檢測(cè)中應(yīng)用較少。本工作采用DNFB柱前衍生 -高效液相色譜法測(cè)定化妝品中16種氨基酸 [ 甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、組氨酸（His）、纈氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、脯氨酸（Pro）、半胱氨酸（Cys）、蘇氨酸（Thr）、谷氨酸（Glu）、賴氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）、精 氨 酸（Arg）、異亮氨酸（Iso）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、丙氨酸（Ala）]的含量，通過煮沸法與磺基水楊酸法相結(jié)合，快速高效地去除了化妝品中的雜質(zhì)，提高了游離氨基酸的提取效率，可為測(cè)定化妝品中氨基酸的含量提供技術(shù)支持。
1、試驗(yàn)方法
稱取樣品置于離心管中，加入水（液體樣品可不加），混勻超聲，加熱煮沸，冷卻。加入磺基水楊酸溶液，渦旋混勻，離心后將全部上清液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用磺基水楊酸溶液定容，備用。
取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液或樣品溶液置于離心管中，加入碳酸氫鈉溶液和DNFB衍生溶液，渦旋混勻，置于 60℃水浴中反應(yīng)，冷卻。用磷酸二氫鉀溶液定容，混勻后按照儀器工作條件測(cè)定。
2、結(jié)果與討論
2.1 色譜行為
按照試驗(yàn)方法測(cè)定40.0mg·L−1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，所得色譜圖見圖1。其中，DNFB的衍生物峰對(duì)整個(gè)試驗(yàn)無影響。
2.2 色譜柱的選擇
色譜柱填充物粒徑越大，分析效率越低，分析時(shí)間越長。為了快速高效地分離16種氨基酸，試驗(yàn)考察了3種不同粒徑的色譜柱 [Spursil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）、X Bridge C18色譜柱（150mm×3.0mm，3.5μm）、Poroshell 120 C18色譜柱（100mm×4.6mm，2.7μm）]對(duì)40.0mg·L−1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物分離效果的影響，見圖2。根據(jù)結(jié)果，試驗(yàn)選擇 X Bridge C18色譜柱進(jìn)行分離。
2.3 流動(dòng)相的選擇
液相色譜分析氨基酸衍生物時(shí)，流動(dòng)相一般以甲醇或乙腈作為有機(jī)相，以磷酸鹽緩沖液作為水相，水相中需要加入三乙胺等離子試劑，試驗(yàn)過程繁瑣且對(duì)儀器損害較大。為降低檢測(cè)成本、延長色譜柱使用壽命，試驗(yàn)選擇相對(duì)溫和穩(wěn)定的乙酸鈉緩沖液為水相。氨基酸衍生物極性較強(qiáng)，而乙腈的洗脫能力強(qiáng)、分子結(jié)構(gòu)大、雜質(zhì)含量低，試驗(yàn)以0.05mol·L−1乙酸鈉緩沖液（pH 6.5）為水相，考察了分別以體積比4∶1，1∶1，3∶7的乙腈-水混合溶液為有機(jī)相時(shí)對(duì)目標(biāo)物分離效果的影響。
根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)選擇的流動(dòng)相水相為含1%DMF的0.05mol·L−1乙酸鈉緩沖液（pH 6.5），有機(jī)相為體積比1∶1的乙腈 -水混合溶液。
2.4 檢測(cè)波長的選擇
根據(jù)氨基酸中氮的位置，氨基酸主要分為一級(jí)氨基酸和二級(jí)氨基酸。為了確定不同氨基酸與DNFB產(chǎn)生的衍生物的特征峰及保留時(shí)間，試驗(yàn)以單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液為研究對(duì)象，借助儀器的紫外光譜分析確定不同氨基酸衍生物的最大紫外吸收峰，結(jié)果見圖3。
結(jié)果顯示：除二級(jí)氨基酸Pro的最大紫外吸收峰在387nm，其他氨基酸的最大紫外吸收峰聚集在（360±6）nm。因此，試驗(yàn)選擇的檢測(cè)波長為360nm。
2.5 衍生時(shí)間的選擇
氨基酸與DNFB于60℃發(fā)生衍生反應(yīng)需要30，60min，衍生時(shí)間較長。試驗(yàn)以衍生反應(yīng)開始前的溶液體系為基底進(jìn)行校零，考察了衍生時(shí)間為10，20，30，40，50，60min 時(shí)對(duì)吸光度的影響。結(jié)果顯示，在上述不同的衍生時(shí)間下吸光度基本不變，說明在60℃水浴加熱條件下，10min即可完成衍生反應(yīng)。因此，試驗(yàn)選擇的衍生時(shí)間為10min。
2.6 提取方法的選擇
為確定化妝品中氨基酸的提取方法，分別在化妝品中加入不同質(zhì)量濃度（40.0，4.0，0.4mg·L−1）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察了3種不同提取方法（方法A，煮沸+磺基水楊酸法；方法 B，活性炭法；方法C，煮沸+活性炭法）對(duì)氨基酸回收率的影響，結(jié)果見圖4。
根據(jù)結(jié)果，試驗(yàn)選擇的提取方法為煮沸+磺基水楊酸法。
2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限
按照試驗(yàn)方法衍生和測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以各氨基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)衍生物的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，16種氨基酸的質(zhì)量濃度在0.004~40.0mg·L−1內(nèi)與對(duì)應(yīng)衍生物的峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。
表1 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限
按照3倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限（3S/N），按10倍檢出限計(jì)算測(cè)定下限，結(jié)果見表1。
2. 8 精密度和回收試驗(yàn)
按照試驗(yàn)方法對(duì)空白化妝品進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定7次，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。
表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果（n=7）
結(jié)果顯示：16種氨基酸的回收率為 89.0%~ 105%，測(cè)定值的RSD均不大于10%，說明方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。
2.9 樣品分析
按照試驗(yàn)方法測(cè)定市售化妝品中氨基酸的含量，結(jié)果見表3。其中，編號(hào)1~4為膏體樣品；編號(hào)5~8為水劑樣品；編號(hào)9~11為乳劑樣品。
表3 樣品分析結(jié)果
結(jié)果顯示：膏體樣品、水劑樣品均檢出標(biāo)簽明示的氨基酸成分；乳劑樣品中兩個(gè)樣品未檢出標(biāo)簽明示的氨基酸成分，可能此氨基酸的添加量低于檢出限，也可能并未添加此氨基酸。
3、試驗(yàn)結(jié)論
本工作采用DNFB柱前衍生 -高效液相色譜法測(cè)定化妝品中16種氨基酸的含量，方法快速、準(zhǔn)確，可以應(yīng)用于化妝品中氨基酸含量的測(cè)定。
作者：王丁林，張娜娜，周耀斌
單位：上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，國家保潔產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心
來源：《理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)》2024年第7期
來源：理化檢驗(yàn)化學(xué)分冊(cè)
