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嘉峪檢測網 2024-09-26 16:56
摘要
病毒樣顆粒（VLPs）是一類能夠自行組裝，具有重復抗原表位，能夠刺激機體免疫反應且不含病毒遺傳物質的蛋白納米顆粒。在疫苗研發、藥物靶向運輸和生物工程材料方面VLPs具有重要的研發價值和應用潛力。本研究對VLPs疫苗誘導免疫反應的機制、現有的VLPs表達技術、防治病毒感染等方面的研究進展進行了綜述，為VLPs疫苗的設計和研發提供參考。
疫苗接種能夠以低成本且高效的方式應對公共衛生事件與各種流行病的傳播，是人類目前最為重要的醫療干預措施之一［1］。目前的疫苗種類包括減毒疫苗、滅活疫苗、核酸（DNA/RNA）疫苗和亞單位疫苗等。其中減毒或滅活疫苗含有已經減弱毒力或失去活性的病原體以模擬疾病感染從而獲得免疫力；核酸疫苗遞送病原體遺傳物質進入人體，激活免疫系統引起免疫應答；亞單位疫苗的抗原成分為病原體的選定片段，包括抗原多肽、蛋白、多糖以及可形成病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）的病毒結構蛋白等。與其他類型疫苗相比，亞單位疫苗具有明確的靶抗原成分，可以彌補其他疫苗因抗原變異、毒力返祖等引起相關的安全性問題，以及嚴格的儲存要求和針對快速突變的病原體較低功效等功能性缺陷［2,3］。作為亞單位疫苗的一種，VLPs近些年來在生物醫學與生物工程學領域扮演著重要的角色，成為疫苗開發領域極具潛力的研發方向［4］。
VLPs是一種能夠自組裝的納米顆粒，其組成成分包括病毒衣殼蛋白、核心蛋白或包膜蛋白等能夠刺激人體產生免疫力的特定病毒蛋白，分為有包膜和無包膜VLPs。VLPs同時也可以由非病毒或人工合成方式形成的具有一定對稱結構的蛋白納米顆粒［5］。由于其內部不具有病毒核酸成分，因而不具有感染性。VLPs可以自組裝成二十面體、桿狀或球狀等結構，能夠通過原核細胞系，酵母細胞系統，植物細胞，動物細胞等進行重組表達的方式人工獲得。VLPs最早作為在原子水平上分析病毒結構的重要工具，隨著深入的研究其逐漸被用于多個領域。VLPs作為能夠加載各種藥物產品將其遞送至特定的細胞或組織的納米載體正在被開發成為藥物遞送系統［4］。在疫苗研發領域，VLPs被用于抗病毒、抗菌以及腫瘤疫苗等方向的研發。VLPs可以組裝成類似于天然病毒結構的空間立體構型，具有重復抗原表位，能夠以高價態形式刺激機體免疫反應；納米級別的尺寸使其能高效被免疫細胞攝取而進入淋巴系統；其表面可以展示不同來源的抗原結構，便于根據不同病原體而定制化設計疫苗；并且其具有免疫佐劑效應，能夠模擬病毒感染并刺激人體的免疫系統從而誘導產生免疫保護反應。廣泛的抗原來源為VLPs疫苗的開發提供了多種應用場景，能夠使用不同重組表達體系進行大規模生產等優點使得VLPs疫苗的開發更具經濟效益。與此同時，VLPs疫苗本身仍存在一些不足之處，如誘導CD8+T細胞免疫的效果可能不夠理想，可以通過結合使用刺激細胞免疫的佐劑或抗原來改善其效果［6］。與其他類型的疫苗類似，VLPs疫苗可能會引起注射部位腫脹或疼痛，且部分接種人群可能預先感染過此類病毒，并阻礙機體對此類VLPs疫苗的免疫應答［7,8］。
本文綜述了VLPs疫苗誘導產生免疫反應的機制，總結了VLPs疫苗的表達平臺，列舉和歸納了現階段VLPs疫苗針對相關疾病的實際應用，對VLPs疫苗存在的優點與不足進行了概括總結，為VLPs抗病毒疫苗的設計和研發提供了參考。
一、VLPs疫苗誘導免疫反應的機制
作為亞單位疫苗的一種，VLPs疫苗可以很好地克服傳統疫苗使用具有感染性或滅活病原體的局限性來實現其安全性和有效性［9］。不同于一般的亞單位疫苗，VLPs蛋白顆粒保留了天然病毒特征性的結構蛋白，包含具有免疫原性的抗原基序。VLPs可以自組裝成蛋白顆粒，且在VLPs內部也不具有病毒核酸成分，因此可以模擬天然病毒類似的感染途徑被免疫系統識別和加工而沒有毒力返祖的風險。VLPs表面可以通過多價的形式呈現不同來源病原體的抗原表位。同源VLPs含有天然病毒蛋白質，異源VLPs由于含有不同來源的抗原成分能夠獲得針對多種不同病原體的免疫原性，這些特點使VLPs具有能夠在體內誘導體液和細胞免疫反應的能力［9,10,11］。
VLPs疫苗進入體內后，細胞攝取VLPs的途徑分為多種類型。除了非特異性的吞噬、巨吞飲作用外，還可以通過網格蛋白依賴和非依賴（受體介導）等內吞形式攝取VLPs［6］。VLPs自身含有的病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），能夠與抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC）如樹突狀細胞（dendritic cell，DC）細胞表面或內部的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）如Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）、Nod樣受體（nod-like receptor，NLR）和RIG l樣受體（RIG-I-like receptors，RLR）等發生結合并活化APC。相比其他APC，DC能夠更有效地攝取VLPs［10，12］。VLPs進入APC胞內，在吞噬溶酶體中被消化，加工得到的抗原肽被加載到主要組織相容性復合物（MHC）Ⅱ類分子上并呈遞給CD4+輔助性T細胞（helper t lymphocyte，Th）。Th細胞通過表面的TCR識別MHCⅡ分子提呈的抗原表位，在細胞因子信號和共刺激信號的共同作用下刺激B細胞的增殖與活化，在Th細胞相互作用下，促進抗體和記憶性B細胞的產生［13］。由于VLPs能夠與B細胞表面BCR發生高度交聯，還可以直接活化B細胞誘導T細胞非依賴性的體液免疫反應［13,14］。VLPs的高度重復表面可以促進與先天性體液免疫成分的相互作用，介導APC的調理和吞噬作用，APC被VLPs激活后能夠促進基于T、B細胞的免疫反應［15］。除了刺激CD4+T細胞活化，VLPs還能夠通過交叉遞呈途徑誘導CTL細胞免疫應答。VLPs的抗原呈遞并不局限于MHC-Ⅱ，顆粒狀VLPs可以被APC攝取并將抗原片段交叉呈遞于MHC-Ⅰ類分子表面，促進CD8+T細胞活化。VLPs抗原片段加載于MHC-Ⅰ分子的過程可以通過與抗原轉運蛋白（transporter-associated with antigen processing，TAP）非依賴性或TAP依賴性內體途徑相關的轉運蛋白來實現。活化的CTL細胞能夠通過釋放穿孔素和顆粒酶，或經死亡受體和死亡受體配體（Fas/FasL）途徑有效殺傷靶細胞［9，16,17］。見圖1。
圖1病毒樣顆粒疫苗的表達平臺和誘導免疫反應的機制
在設計VLPs疫苗時，模式識別受體（如TLR7、8、9等）的活化對于適應性免疫應答的激活起到重要作用。可以將外源性佐劑如CpG、ssRNA等共價結合至VLPs表面或者包裝于VLPs內部，從而對模式識別受體產生更好的活化作用。在設計誘導CTL的VLPs疫苗時，CpG是常用的佐劑之一。CpG能夠活化TLR9，產生Th1偏向性免疫反應，引發強烈的T、B細胞反應，誘導生產更加長壽的漿細胞，長期維持高水平的抗體滴度［8］。通過將ssRNA封裝于VLPs內部，被免疫細胞攝取后ssRNA能夠結合并激活Toll樣受體如TLR7和TLR8，引發下游信號轉導，誘導細胞因子（TNFα、IFNα、IFNγ和IL-6等）的表達，在較低劑量下誘導機體免疫應答［7］。基于諾如病毒（GII.P16-GII.2型）VLPs疫苗的研究中發現，和DC相比，VLPs能夠更加有效地激活巨噬細胞表型的成熟，促使巨噬細胞進行M1型方向的活化并釋放炎性細胞因子，活化CD4+T細胞引發Th1型免疫應答，誘導細胞和體液免疫應答［18］。
二、VLPs的重組表達技術
穩定且可靠的表達平臺對于VLPs疫苗的生產至關重要。VLPs表達平臺應具有高效率、高產量、便捷、快速、低成本、安全生產等特點［6，19］。VLPs表達系統還需確保蛋白質能夠進行正確地折疊和翻譯后修飾，這些條件與VLPs疫苗能否實現刺激免疫應答的功能直接相關［5］。目前能夠用于VLPs的表達平臺包括細菌、酵母、桿狀病毒/昆蟲細胞（B/IC）系統、哺乳動物細胞、植物、活動物和無細胞系統等［5,6，19］。
細菌表達系統是目前應用最廣泛的重組蛋白表達系統之一。目前成功表達的174種不同類型的VLPs中，約28%是在細菌系統中表達的［20］。細菌本身存在翻譯后修飾（posttranslational modification，PTM）能力有限、表達的蛋白可能存在溶解度低和二硫鍵錯配等問題，此體系適用于包含一種或兩種病毒結構蛋白的無包膜VLPs的重組表達。由于原核表達系統的安全性、成本效益以及能滿足全球性的使用等優勢，基于原核細胞的表達系統仍被視為生產VLPs的最佳平臺［5，20,21,22］。其中大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是最為常見的VLPs細菌表達平臺，其生產成本低、表達水平高、易于放大且周轉時間短，常被用于生產結構相對簡單且PTM需求不高的VLPs疫苗［5，20］。Hecolin是第一個成功商業化的戊型肝炎病毒（hepatitis e virus，HEV）VLPs疫苗，其生產使用E.coli表達平臺［20］。利用E.coli表達體系，通過與大腸桿菌中的噬菌體QβRNA進行抗原綴合開發了多種針對非感染性疾病（包括高血壓、過敏、糖尿病、癌癥和阿爾茨海默病等）的嵌合VLPs疫苗［5］。
酵母細胞是研究最深入的真核表達體系之一，是基因工程生物材料與重組蛋白藥物制劑的優良表達宿主［23］。酵母作為重組表達體系具有成本低、產率高、純化簡單、支持高密度發酵和分泌表達等優勢。此外，酵母避免了細菌和哺乳動物細胞等內毒素和病毒污染等相關的問題。不同于原核系統，酵母體系的PTM能夠幫助重組蛋白形成正確構象并更好地發揮其生物學效應［22,23,24,25］。由于酵母表達體系在蛋白質糖基化方面與哺乳動物細胞存在差異，因此酵母常被用作生產無包膜VLPs［21］。首個酵母系統表達的HBV-VLPs疫苗于1986年獲得美國FDA批準后，基于酵母體系表達的多種VLPs疫苗陸續獲批上市或進入臨床實驗［21，26］。基于畢赤酵母系統的基孔肯雅病毒（chikungunya virus，CHIK）VLPs疫苗在小鼠模型中免疫效果評估與滅活病毒相當［26］。
相較于其他表達體系，哺乳動物細胞表達的目標蛋白質產量相對較低，但其在蛋白折疊、組裝與形成完整的PTM方面具有優異的表現［5，27］。目前，市場上幾乎50%以上的生物制藥產品和臨床開發中的候選產品都基于哺乳動物細胞表達體系，動物細胞表達體系能夠被用來表達包膜和無包膜VLPs［28］。包括倉鼠卵巢細胞（CHO）、人胚腎293（HEK 293）細胞、幼倉鼠腎細胞（BHK-21）、CAP-T和Vero等多種動物細胞系被用于生產重組VLPs［5，28］。CHO細胞被用于表達HBsAg VLPs、登革熱病毒和漢坦病毒VLPs，HEK296細胞和CAP-T細胞系能夠用于HIV-VLPs的高效表達［29,30,31］，Vero E6細胞系成功表達了SARS-CoV-2VLPs用于臨床測試［32］。
桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統（baculovirus/insect cell expression system，B/IC）同樣常用于生產包膜和非包膜VLPs［5］。B/IC系統可以產生與細菌和酵母系統相當的VLPs表達量，但其由于具有相對于原核體系更強的PTM效果和作為基因治療載體的能力在藥物研發和生產方面更具優勢［22］。桿狀病毒表達載體系統（baculovirus expression vector system，BEVS）平臺作為抗病毒疫苗成熟的生產平臺，具有速度快、靈活設計和可擴展性等優勢。桿狀病毒具有自發感染昆蟲細胞的傾向，利用B/IC平臺生產VLPs能夠達到商業化規模的需求［33］。桿狀病毒表達體系設計快速且簡便，有助于生產表面結構蛋白易發生變異的傳染性疾病疫苗［22］。基于B/IC表達系統的HPV疫苗Cervarix是一種由HPV 16和HPV 18 L1 VLPs構成的二價HPV疫苗，于2009年獲得FDA批準上市［5］。
植物表達系統是有效且可擴展的VLPs表達平臺，生成的重組蛋白具有可溶性好、低成本、蛋白表達水平高和蛋白質正確折疊能力優良等優點［5］。在葉綠體中表達的生物制藥產品和疫苗可以在合適溫度下穩定保存多年，并且保留蛋白質正確折疊的構象和生物學效應［34］。葉綠體基因工程可以將基因整合到高度多倍體的葉綠體基因組中（每個細胞多達10 000個基因拷貝），因而可以產生高水平的外源蛋白質表達［35］。植物細胞還可以用植物病毒遞送外源基因進行表達，如使用煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）進行重組表達產量大、效率高，是重組植物疫苗的里程碑［36,37］；煙草植物、馬鈴薯塊莖等植物重組表達體系已經成功表達了HBV、HPV和流感VLPs疫苗［5］。由于植物來源的VLPs有高度有序的重復堆積結構，比體內的可溶性蛋白質更能抵抗消化酶的作用，一些植物來源的VLP疫苗可以實現口服給藥［36］。
無細胞蛋白合成系統（cell-free protein synthesis，CFPS）也可以用于VLPs的生產，通過保留蛋白質合成能力的細胞提取物，為蛋白質的體外生產提供了更多的選擇［5，38］。作為合成生物學的關鍵平臺，CFPS系統節省時間，蛋白產量大，可以避免蛋白質對活細胞的毒性，并且能夠將人工合成的非天然氨基酸引入VLPs疫苗結構中，是VLPs疫苗生產一種有廣闊前景的工具［6，39,40］。活體動物如寄生蟲表達系統也可以用于VLPs的表達，此系統不僅具有形成蛋白質天然構象和完整的PTM的優勢，而且更加安全高效。利用非致病性利什曼原蟲L.tarentolae表達VLPs可以為VLPs疫苗的生產提供替代方案［41］。
VLPs在重組表達和生產過程中，蛋白質的正確折疊和PTM的程度是選擇適合表達系統的關鍵性因素。對于有包膜的VLPs的大規模生產可以選擇哺乳動物、昆蟲細胞或無細胞系統進行表達；而對于無包膜VLPs可以選擇經濟快捷的細菌或酵母體系；針對快速變異的病毒如流感病毒等同樣可以選擇原核細菌體系，便于快速應對病毒突變株帶來的威脅。總體來說，細菌體系和酵母體系經濟快捷，易于生產，但細菌體系缺乏PTM體系，酵母則不具有形成復雜PTM的體系，常用于無包膜VLPs的生產。B/IC系統和植物細胞表達系統表達量高，成本經濟，但B/IC系統其N-糖基化相對簡單，可能會是其潛在缺點。哺乳動物細胞PTM程度高，有利于復雜結構VLPs疫苗的生產；但其主要劣勢在于生產成本高，且產量較低。無細胞系統進行VLPs的表達其產量近些年來得到了提升，但其商業化應用受限于生產成本，一般作為額外的選擇方案［5］。
三、VLPs抗病毒疫苗的主要研究進展
VLPs由于保留了天然病毒的有效抗原表位，并且不含病毒遺傳物質，不具有感染性，因此在抗病毒疫苗的研發方面具有天然優勢。本文歸納了VLPs疫苗在乙型肝炎病毒、腸道病毒、寨卡病毒、人乳頭瘤病毒、流感病毒和新型冠狀病毒等方面的主要研究進展（表1）。
表1 病毒樣顆粒抗病毒疫苗的應用進展
注：HBV為乙型肝炎病毒；HPV為人乳頭瘤病毒；EV為腸道病毒；CPMV為豇豆花葉病毒；WHcAg為土撥鼠肝炎核心抗原；HBcAg 為乙肝病毒核心抗原；HA為血凝素；NA為神經氨酸酶
（一）乙型肝炎病毒疫苗
乙肝病毒（hepatitis b virus，HBV）感染是全球所面臨的一個重大公共安全問題，接種乙肝疫苗是目前最有效的預防策略。第一代乙肝疫苗屬于血漿衍生疫苗，在當時針主要對于高危人群使用。第二代基因工程疫苗使用乙肝表面抗原（hepatitis b surface antigen，HBsAg）作為主要抗原，使用酵母細胞進行表達且能夠自組裝為病毒樣顆粒。二代HBV疫苗是第一個獲批上市的VLPs疫苗，其顯著降低了HBV的全球流行率，在疫苗學領域具有里程碑式的意義［9，42］。基于HBsAg-VLPs的第三代HBV疫苗Sci-B-Vac™在第二代疫苗的基礎上進行優化，含有S蛋白、Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白3種抗原組分，使用哺乳動物CHO細胞進行表達，能夠在低劑量（2.5~10μg）誘導下獲得高滴度的抗HBsAg和針對Pre-S蛋白的保護性抗體［43］。第三代HBV疫苗目前已經獲批在東亞的14個國家等使用，安全使用人數達到30多萬人。其在老年人或免疫功能低下以及腎臟移植等患者中仍然收獲了良好的免疫效果，并有望成為慢性HBV感染的治療性疫苗［9］。Pre-S抗原可以提供T細胞和B細胞表位，誘導細胞免疫與體液免疫，有望作為新型HBV疫苗的潛在抗原成為HBsAg的替代和補充［44］。使用流感病毒M1蛋白和流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）的跨膜結構域和胞質尾部結構域作為支架組成的Pre-S VLPs，在動物實驗中誘導了高水平的體液與細胞免疫反應。該疫苗在保護小鼠免受HBV DNA的流體動力學轉染方面也表現出明確的效果，表明了其在新型HBV預防和治療性疫苗方向具有潛力［44］。通過生物和免疫信息學評估和設計的一種基于乙肝核心抗原（hepatitis b core antigen，HBcAg）且含有HBsAg免疫原性結構域的VLPs疫苗，將HBsAg的抗體結合片段置于HBcAg的主要免疫優勢區（major immunodominant region，MIR）表位來刺激多邊免疫反應，以獲得針對HBV的廣泛和特異性的B和T細胞應答［45］。與在酵母中表達的HBsAg相比，無論有無佐劑，在HEK293F細胞中表達的高度N糖基化的HBsAg VLPs在BALB/c小鼠模型中均顯示出增強的免疫原性［46］。為了應對免疫耐受造成的預防性疫苗對慢性肝炎無效的問題，可以將包膜PreS1區域的8個B細胞中和表位結合到土撥鼠肝炎核心抗原（woodchuck hepatitis virus core antigen，WHcAg）上形成PreS1-WHcAg VLPs治療性疫苗，由于WHcAg和HBcAg無B細胞表位交叉反應性，且CD4+T細胞和CD8+T細胞表位部分同源，該疫苗可以誘導CD4+T細胞依賴的B細胞活化產生抗體，從而產生特異性抗體以克服免疫耐受。WHcAg VLPs疫苗在HBV免疫耐受的轉基因小鼠模型中引起了相當于野生型小鼠的高滴度PreS1中和抗體水平，有望應用于CHB的治療［47］。
（二）腸道病毒疫苗
腸道病毒屬于小RNA病毒科，其中腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒A16（coxsackie virus A16，CV-A16）多引起手足口病，脊髓灰質炎病毒（Poliovirus，PV）同樣屬于腸道病毒家族［48,49］。目前我國已經有3種針對EV71的滅活疫苗獲批［50］。滅活疫苗因相對活疫苗較為安全，但其免疫原性不持久，僅能啟動體液免疫而缺乏細胞免疫，且存在抗原表位受損的風險。重組VP1疫苗產生中和抗體水平不高，有抗體依賴性增強（antibody-dependent enhancement，ADE）的風險［50］。EV71包含P1、P2和P3的單鏈陽性RNA基因組，通過蛋白酶3CD可以將P1蛋白加工成為VP1、VP3以及VP0，這三者可以自發組裝成為正二十面體VLPs［50］。重組表達的EV71 VLPs在小鼠模型中誘導的IgG水平與滅活EV 71相似，雖然中和滴度方面低于滅活疫苗，但VLPs疫苗能夠抑制EV71從中樞神經系統到肌肉組織的轉運［51］。隨著腸道病毒嵌合抗原研究的深入，用于手足口病（hand foot mouth disease，HFMD）防治的多價VLPs疫苗的可行性不斷提高。通過將EV71的衣殼蛋白VP1的SP70表位替換為CV-A16形成的二價嵌合體疫苗EV-A71 VLPs（ChiEV-A71 VLPs），在小鼠模型中能夠有效誘導針對EV71和CV-A16的細胞和體液免疫應答［52］。提高重組表達EV71 VLPs疫苗產量，是EV71疫苗開發和市場化的關鍵。通過基于密碼子優化的P1和3C基因，在畢赤酵母表達體系中表達EV71-VLPs，其表達量可達270 mg/L，遠高于Vero細胞中1.5 mg/L的表達量。此外，使用昆蟲細胞/桿狀病毒系統構建雙啟動子表達P1和3CD的EV71 VLPs疫苗能夠提高疫苗產量，這表明并入不同啟動子具有優化VLPs產量的潛力［53］。腸道病毒EV-D68能夠引起兒童呼吸道疾病，少數還會造成急性弛緩性脊髓炎（acute flaccid myelitis，AFM）等疾病。利用EV-D68 VP蛋白（VP0、VP1、VP3）形成的VLPs疫苗對同源或異源EV-D68亞型均有保護性中和抗體產生，在體內能夠防止病毒的全身性傳播［54］。VLPs疫苗同樣可以用于腸道病毒PV引起的脊髓灰質炎的預防，重組表達的PV的結構蛋白能夠自發形成VLPs結構刺激機體產生保護性抗體。PV的P1衣殼蛋白與3CD蛋白酶共表達并且經3CD酶切后能夠形成VLPs結構并刺激機體產生保護性抗體。通過B/IC平臺表達的VP1、VP2和VP3結構蛋白具有熱穩定性，自組裝形成的PV1、PV2和PV3 PV-sVLPs在動物實驗中能夠在小鼠脾臟中誘導產生大量的白介素（interleukin，IL）如IL-2、IL-5和干擾素γ（interferonγ，IFN-γ）等細胞因子，刺激機體產生強大的體液與細胞免疫［55］。在BHK-21哺乳動物細胞系統表達中以改良的痘苗病毒為載體，通過P1和3CD共表達形成的PV3 SC8 VLPs，實驗動物模型中產生了有效的保護性抗體滴度［56］。
（三）寨卡病毒疫苗
寨卡病毒（zika virus，ZIKV）是一種屬于黃病毒科黃病毒屬的蟲媒病毒［57,58］。2015年由美洲開始蔓延至亞非等多個地區，其感染可能引發先天性小頭畸形和自身免疫性神經系統疾病格林-巴利綜合征等癥狀［59］。目前尚無獲批的ZIKV疫苗，但已有候選疫苗進入臨床試驗［60］。E蛋白是黃病毒的主要表面蛋白，參與病毒與細胞表面的結合以及膜融合，ZIKV病毒表面E蛋白拷貝數多達180個。E蛋白單體包含EDⅠ、EDⅡ和EDⅢ三個結構域，其中EDⅢ結構域是生成特異性中和抗體的主要靶標抗原，因此成為疫苗研發的重點［60,61］。通過結構蛋白（C-PrM-E）和非結構蛋白（NS2B-NS3）自組裝形成ZIKV-VLPs疫苗，在小鼠模型中產生的中和抗體滴度顯著高于ln-ZIKV（滅活疫苗）對照組［62］。將編碼ZIKV結構蛋白PrM-E基因的質粒DNA引入HEK293哺乳動物細胞中表達的VLPs能夠在小鼠和非人靈長類動物中誘導產生中和抗體，并使宿主免受感染［63］。使用ZIKV EDⅢ和HBV核心抗原設計的嵌合VLPs，可以提高VLPs疫苗的靶向性，防止交叉反應性黃病毒抗體的產生，并且能夠引發強烈的體液和細胞免疫反應，具有預防抗體依賴性增強（antibody-dependent enhancement，ADE）效應和提高免疫效率方面的潛力［61］。使用腺病毒載體表達C蛋白、PrM蛋白和E蛋白組裝生成的ZIKV-VLPs顆粒，使用氫氧化鋁、AddaVaxTM和MF 59®作為佐劑，在動物實驗中均顯示接種后2~6個月能夠檢測到中和抗體的產生，表明其可以作為寨卡病毒疫苗單劑量疫苗候選物［64］。使用土撥鼠WHcAg作為支架嵌合EDⅢCD環亞結構域形成的VLPs疫苗，在小鼠模型中顯示出了Th1和Th2型介導的免疫反應，并能刺激產生與抗體依賴性細胞毒性（antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC）和補體依賴性細胞毒性（complement dependent cytotoxicity，CDC）相關的保護性抗體［65］。將ZIKV EDⅢ嵌合在HBcAg VLPs表面與植物制備的由IgG重鏈和ZIKV EDⅢ融合蛋白組成的重組免疫復合物（recombinant immune complex，RIC）進行共同遞送能夠產生增強的免疫效果［66］。EDⅢ和IgG重鏈N或C末端融合形成的N-RIC和C-RIC與EDⅢ-HBcAg VLPs共同進行遞送在動物實驗中能夠產生協同效應，產生中和抗體的水平均強于單獨使用RIC或EDⅢ-HBcAg VLPs進行誘導。
（四）人乳頭瘤病毒疫苗
人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）基因組由雙鏈環狀DNA組成，其晚期區（late region，LR）編碼HPV主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2，前者是目前HPV疫苗設計的主要靶點［67］。主要衣殼蛋白L1可以自組裝成具有免疫原性的VLPs，目前已有多款基于L1的VLPs疫苗獲批上市，其在預防同型HPV感染的有效性和安全性方面得到了臨床驗證［68］。Merck公司在2006年獲批的四價HPV疫苗Gardasil用于預防6、11、16、18型HPV引起的宮頸癌和生殖器疣狀物，隨后開發的二價疫苗Cervarix針對預防HPV的16、18高危型引起的宮頸癌也于2009年被美國食品藥品監督管理局（food and drug administration，FDA）批準使用［69］。2014年Gardasil 9被美國FDA批準使用于9~26歲的女性和9~15歲的男性，相比于二價和四價HPV疫苗，Gardasil 9不僅含有HPV 9、11、16、18 L1 VLPs，還包括了31、33、45、52和58 L1 VLPs［67，69,70］。HPV52 L1 VLPs疫苗將HPV 52的L1基因進行了基于畢赤酵母表達系統的密碼子優化，經重組表達的HPV52 L1能夠成功組裝成VLPs顆粒。酵母系統表達的HPV52 L1成本較低，具有作為在亞洲等地流行的HPV52低成本疫苗的潛力［71］。使用VLPs作為模板與二氧化硅佐劑通過自組裝能夠形成樹莓樣VLP@Silica納米疫苗，當使用HBsAg或HPV 18 L1 VLPs作為抗原時，能夠增強特異性抗體的產生和T細胞介導的細胞免疫應答［72］。不同于L1抗原表位，L2表位可以針對不同類型的HPV產生交叉保護作用，針對HPV L2保守表位的候選疫苗有望成為Gardasil 9的替代和補充。通過在噬菌體MS2表面展示串聯的HPV31/16 L2抗原表位形成的MS2-L2 VLPs疫苗，在小鼠模型中產生了針對不同類型HPV L2表位的高滴度抗體［73］。基于生物信息學分析和免疫原性優化構建的包含了39、68、70三種基因型L1免疫顯性區域的H39-68FG70-DE嵌合體VLPs，在動物實驗中不僅能夠引發針對三種血清型的中和抗體，而且在較低劑量下實現了相當于多價疫苗或更好的交叉中和水平［74］。包含HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59在內的14種型別的重組多價L1 VLPs疫苗，具有比Gardasil 9更高的免疫保護范圍，并且已經進入Ⅱ期試驗［75］。將源自L2保守表位的αHPV和一致性序列βHPV序列展示在HPV16/18 L1的DE環內形成的RG2-VLPs，使用明礬作為佐劑能夠有效的誘導L2特異性抗體，避免β型HPV 5的感染。在兔模型中可以避免17種αHPV的感染，具有預防肛門、生殖器癌和乳頭瘤的潛力［76］。
（五）流感疫苗
除了當前引起大流行的SARS-CoV-2病毒，流感病毒也是具有季節性和周期性流行的病原體之一。人流感病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，其中甲型流感病毒抗原性易發生變異，曾經引起世界范圍的大流行［77］。HA是流感疫苗開發的主要靶標，以HA作為主要抗原的首個重組流感疫苗FluBlok在2013年獲得美國FDA批準［78］。重組VLPs疫苗可以實現流感疫苗的快速制備，應對大威脅流感病毒。植物表達體系可以用于生產基于HA的VLP疫苗［79］，昆蟲細胞Sf9產生的甲型流感VLPs，其產量比HEK293細胞高大約35倍，并且高產率的同時VLPs引起的抗體滴度也更高，優于其他表達系統，有利于商業化生產［77］。由于HA容易產生抗原漂移，因此需要每年進行流感疫苗的更新［80］。神經氨酸酶（neuraminidase，NA）同樣屬于流感病毒的表面蛋白，與HA相比其抗原發生漂移較慢，是流感疫苗重要的抗原表位。由HA和NA構成的N1 VLPs疫苗可以提供對不同抗原HA的流感病毒提供交叉免疫保護，誘導Th1型免疫應答和中和抗體的產生［81］。使用來自A/Anhui/1/2013（H7N9）的HA和NA和來自A/Indonesia/05/2005（H5N1）的基質蛋白M1組裝形成的H7N9 VLPs疫苗，動物實驗顯示H7N9 VLP可以產生對同源H7N9的血凝抑制反應和對異源H7N9的交叉性血凝抑制反應，并且在加入皂苷類佐劑后，其反應會提高3~4倍［82］。HA與唾液酸（sialic acid，SA）受體的結合在流感病毒感染過程中扮演著重要的作用。通過測試對比野生型H1-VLPs和無法結合SA的流感病毒H1（H1N1 A/California/07/09）VLPs疫苗（H1Y98F-VLP），接種H1Y98F-VLP疫苗的小鼠由于改善了淋巴細胞生發中心的生成，能產生更強烈持久的體液免疫反應。該結果表明消除HA-SA的結合有望增強流感疫苗免疫反應的質量和持久性［83］。由于流感疫苗容易發生抗原漂移的特點，開發流感病毒通用疫苗具有重要意義。這類疫苗的設計中可以包含更多的保守序列作為抗原表位，如M2蛋白的胞外區、HA的莖區和核蛋白等［78］。將M2蛋白、甲流病毒NA莖部和IL-12構成的嵌合體細胞因子（chimeric cytokines，CC）連接在流感病毒血凝素HA表面形成的融合蛋白CCFKH5-VLPs，在小鼠模型中顯示出了針對多種同源和甲型流病毒亞型的廣泛交叉保護作用，表明流感病毒保守區域和細胞因子序列的使用在流感通用疫苗的開發設計方面極具潛力［84,85］。將SARS-CoV-2刺突蛋白受體結合結構域（receptor binding domain，RBD）通過化學修飾結合在滅活的流感病毒表面形成的Flu-RBD VLPs疫苗，不僅能夠誘導針對SARS-CoV-2 RBD特異性IgG抗體的產生，還能產生流感病毒HA特異性免疫應答，該疫苗在小鼠模型中表現出對SARS-CoV-2 Delta變異體和野生型H1N1滅活病毒的中和能力［86］。相比于游離型RBD和單純RBD和Flu混合物，這種疫苗具有增強的誘導細胞免疫與體液免疫的能力。
（六）新型冠狀病毒疫苗
自WHO自2020年3月將SARS-CoV-2確定為大流行以來，其在全球引起了較高的發病率與死亡率［87］。SARS-CoV-2具有E、M、N和S四種主要結構蛋白，目前大多數疫苗的設計僅通過靶標S蛋白以引發針對RBD的中和抗體來預防感染和降低重癥率，大多數基于VLPs的疫苗仍需要通過臨床實驗的驗證［87,88］。使用重組桿狀病毒系統對SARS-CoV-2 M和S蛋白進行共表達形成的VLPs疫苗，在倉鼠體內能夠誘導中和抗體的產生并且減輕實驗動物肺部感染的癥狀［89］。由Medicago Inc.和葛蘭素史克開發的CoVLP使用流感病毒H5N1（A/Indonesia/5/2005）的HA跨膜和胞質區尾部對S蛋白同類區域進行替換，生成的VLPs疫苗其有效性在臨床實驗中得到了驗證，目前加拿大政府已經批準此疫苗在其國內的臨床使用［90］。SARS-CoV-2多種值得關注的突變株（variants of concern，VOC）的出現是疫苗設計中面臨的挑戰之一，可以通過尋找VOC中保守的抗原序列進行疫苗設計。通過對SARS-CoV-2抗原表位進行篩選得到的三個中和性表位（570、636和826）在VOC中高度保守，將這三種多肽表位結合至豇豆花葉病毒（cowpea mosaic virus，CPMV）和噬菌體QβVLPs表面形成的三價疫苗制備成微針貼片進行皮下給藥，在動物實驗中產生了針對靶表位和S蛋白的高滴度抗體［91］。
四、結語與展望
VLPs納米顆粒由于其自身獨特的空間結構、良好的安全穩定性、具有重復性抗原表位以及與免疫細胞之間的相互作用使其在疫苗研發、藥物靶向運輸和生物工程材料方面具有重要的臨床應用價值。VLPs自身結構的復雜程度，尤其是含有包膜的VLPs納米顆粒其蛋白表達和工業化生產具有一定挑戰。可以通過設計穩定的真核或無細胞表達體系，人工引入能夠提高表達體系PTMs能力的蛋白酶類，降低有包膜VLPs的表達難度以提高其產量。傳統的方法進行VLPs疫苗的設計和研發測試周期長、過程復雜、結果不確定性較大，很難及時應對病原體快速變異和感染性疾病的快速流行的現狀。隨著生物信息學和免疫信息學的飛速發展，蛋白質結構功能以及抗原與免疫細胞之間相互作用的預測準確性也得到了極大的提高。這將有利于加快VLPs疫苗的設計研發周期，提高VLPs疫苗的臨床有效性，減少或避免VLPs疫苗副作用的產生，進一步降低研發成本，加快VLPs疫苗的臨床轉化和應用，以期為突發性公共衛生事件的應對和相關疾病的防控提供有效解決手段。
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來源：中華預防醫學雜志
