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嘉峪檢測網 2024-12-11 17:27
目的：梳理信使核糖核酸（mRNA）疫苗的開發、應用現狀及產業化挑戰，為國內此類產品的開發提供參考。方法：針對mRNA疫苗的設計、特點、生產及應用現狀的相關研究進行整理、分析，介紹國內外對mRNA疫苗的監管采取的相關舉措，并對這一突破性平臺技術未來產業化應用將面臨的關鍵問題進行總結分析。結果與結論：mRNA技術憑借其通用、快速、靈活的特點應用于不同領域的疫苗/藥物開發，尤其是mRNA疫苗在抗擊新型冠狀病毒肺炎疫情上取得了迅速且顯著的成效，開啟了核酸藥物發展的新時代。為了保障mRNA疫苗的安全、有效、可及，部分國家及地區制定了配套的相關法規，并設立了特別審評部門加強對mRNA疫苗的上市監管。由于產品特性、生產工藝的原因，mRNA疫苗產業化在疫苗可及性、生產管理、質量控制、共線生產導致的系統污染風險、知識產權風險以及新病毒變體的開發等多方面均存在挑戰。
2020年以來，新型冠狀病毒肺炎（CoronaVirus Disease 2019，COVID-19）疫情的發生促成了歷史上最快速的疫苗開發[1-3]。信使核糖核酸（Messenger Ribonucleic Acid，mRNA）技術由于其靈活的設計方式、低免疫原性、易于大規模生產的特點被迅速地應用于新冠疫苗開發，并且通過脂質納米顆粒（Lipid Nanoparticles，LNPs）遞送的mRNA疫苗技術路線在預防COVID-19方面已成為現實[4-5]。
本文對mRNA疫苗的結構設計和特點進行分析，并結合近年來國內外監管情況，探討這一突破性技術平臺未來應用產業化將面臨的關鍵問題。
1、mRNA技術
mRNA技術通過核酸在細胞內表達外源蛋白從而達到表達抗原，激活免疫反應或表達功能正常蛋白，修復受損基因的目的[6]。1990年，Jon Wolff團隊將體外合成的 mRNA經肌肉注射至小鼠骨骼肌內，首次發現在骨骼肌細胞內有特定蛋白質的表達[7]。但是，由于mRNA的不穩定性、高先天免疫原性和較低的體內遞送效率，導致該技術當時并未受到資本的青睞。直至2005年，尿苷修飾mRNA的發現以及遞送技術的不斷發展才給該領域帶來新的生機。2021年，拉斯克獎宣布將臨床醫學研究獎授予Katalin Karikó和Drew Weissma，以表彰他們發現了基于mRNA修飾的新治療技術。
基于mRNA技術的治療手段，根據其潛在作用機制可用于預防性疫苗、治療性疫苗和治療性藥物[8]。
預防性疫苗，主要應用于感染性疾病的預防，通過mRNA來表達病原體的抗原蛋白，從而激發宿主的獲得性免疫反應，產生中和抗體以抵抗病原體的入侵。目前，最為人熟知的預防性mRNA治療臨床實例就是新冠病毒的預防性疫苗，包括2款已經獲得美國食品藥品管理局（Food and DrugAdministration，FDA）批準上市的疫苗和眾多國內外處于臨床階段的疫苗。隨著mRNA序列設計、遞送技術的不斷完善，mRNA技術將不僅在新冠疫苗領域獲得突破性進展，在其他傳染病預防性疫苗例如預防巨細胞病毒（Cyto-megalo Virus，CMV）、寨卡病毒、呼吸道合胞病毒（Respiratory SyncytialVirus，RSV）、流感病毒、狂犬病毒、人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）等也都已經進入臨床開發階段[9-11]。其中，季節性流感疫苗也被多家公司布局，如Moderna公司首款進入臨床開發階段的季節性流感疫苗候選產品mRNA-1010的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗已完成首批受試者接種[12]。
治療性疫苗，是通過打破機體的免疫耐受，提高機體的特異性免疫反應，對一些目前尚無有效治療藥物的疾病起到治療作用。其中包括很多處于臨床研究階段的以腫瘤新生抗原為靶點的個性化癌癥mRNA治療疫苗[13]。這些治療性疫苗通過表達癌癥新生抗原蛋白來激活特異性識別癌細胞新生抗原的細胞免疫，從而殺傷癌細胞達到治療效果。
基于mRNA技術的治療性藥物，其覆蓋范圍則更加廣泛，它們的共同點就是mRNA翻譯產物可以作為發揮治療作用的分子。例如在基于mRNA的基因治療中，mRNA被遞送到有基因缺陷的細胞中，翻譯產生正常功能的蛋白從而補償缺陷基因的部分功能，達到治療效果。Moderna公司研發的針對VEGF-A靶點的mRNA療法正在進行2型糖尿病患者治療的臨床實驗[14]。此外，BNT141也是由BioNTech公司開發的一款編碼Claudin 18.2抗體的mRNA治療藥物，目前正在開展實體瘤治療的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗[15]。國內外多家企業還布局了治療性疫苗（主要為癌癥疫苗）和創新mRNA療法等多個管線，為癌癥、罕見疾病、神經系統疾病等提供更有效、更安全的治療選擇[16-17]。
2、mRNA疫苗
mRNA疫苗的基本概念是利用mRNA編碼抗原，通過體外轉錄技術合成mRNA分子，利用合適的遞送系統將mRNA運輸進入人體，依靠細胞自身的翻譯系統將mRNA翻譯成目標蛋白，從而達到臨床治療或預防的目的[18-19]。
2.1mRNA疫苗的設計
目前研制的mRNA疫苗主要有2種，從結構可分為非復制mRNA和自擴增mRNA。非復制mRNA序列相對較短，有5個關鍵組件構成：5’帽結構（Cap）、5’和3’非翻譯區（UntranslatedRegion，UTR）、開放閱讀框（Open ReadingFrame，ORF）區和3’Poly（A）尾。自擴增mRNA一般基于甲病毒基因組改造而來，其在非復制mRNA的序列基礎上還具有編碼一種RNA依賴的RNA聚合酶復合物的序列。傳統的mRNA疫苗編碼目的抗原，而自擴增mRNA利用一種病毒復制機制，使該種mRNA在細胞內擴增并增加蛋白表達，從而最小化mRNA所需劑量[20-22]。
許多因素會影響mRNA在細胞中的穩定性和蛋白表達，例如：5’UTR 或3’UTR 的選擇、mRNA的二級結構、Poly（A）尾的優化、mRNA 密碼子的優化、修飾核苷酸的選擇等。但是，可以通過修改或更改這些組件以提高mRNA的穩定性、翻譯效率和免疫刺激特征。因此，設計mRNA分子時需綜合考慮這些因素的影響，例如CureVac公司的新冠疫苗CVnCoV，為防止其mRNA被模式識別受體發現的策略就是通過序列工程化和密碼子優化來消除疫苗mRNA中的尿嘧啶，同時提高鳥嘌呤和胞嘧啶占所有堿基的比例[23]。
2.2mRNA疫苗的特點
①與DNA疫苗相比，由于抗原翻譯發生在細胞質而不是細胞核中，不會整合到基因組，沒有造成插入突變的風險，因此，mRNA 疫苗具有更高的生物安全性；
②與基于病毒載體的疫苗相比，mRNA僅具有瞬時活性，通過生理代謝途徑可完全降解，使得mRNA不會長期存留在體內，產生毒性；
③mRNA是通過無細胞酶促轉錄反應產生的，該反應能夠實現快速和可擴展的生產。由于其平臺化的生產方式，編碼不同抗原的mRNA在物理和化學上性質相似，新mRNA疫苗的配方設計和制造過程遵循相同的步驟，因此，更加易于開發且生產工藝相對穩定[24]。
2.3mRNA疫苗的生產方式
mRNA疫苗的技術步驟包括：DNA 質粒構建→體外轉錄→遞送系統裝載。該技術具有平臺化的生產方式，其中最關鍵的步驟就是mRNA的設計以及遞送系統的裝載。由于mRNA是一個包含負電荷的大分子且極不穩定，無法穿過由陰離子脂質構成的細胞膜，且在體內易被核酸酶降解，因此需要創新的遞送載體[25]。如前文所說，mRNA的設計方式將影響mRNA在細胞中的穩定性和翻譯效率，而遞送系統的裝載則直接影響最終產品的穩定性、均一性。這些載體技術主要包括：LNPs、脂質多聚物納米載體技術（Lipopolyplex，LPP）、魚精蛋白載體技術等[26-27]。因此，研發具有自主知識產權的脂質載體也成為mRNA領域研究的熱點和難點。Moderna公司和BioNTech公司開發的2種mRNA新冠疫苗均采用了LNPs遞送技術[28]，將藥物包封于類脂質雙分子層內而形成微型泡囊體，通過非共價親和力和細胞膜結合并通過內吞作用被攝取，進入細胞后，mRNA逃離內吞小泡，被釋放到細胞質中表達靶蛋白。但是，這種技術也存在穩定性較差的問題。因此，新型載體的開發以及多種遞送體系的有機結合方式有望能夠更好地解決遞送系統的細胞毒性以及內吞、逃逸、蛋白表達上所面臨的問題。
3、mRNA疫苗的國內外監管現狀
根據mRNA疫苗作用效果的不同可分為預防性和治療性。通常預防性疫苗的審評主要由各國/地區的藥品監管機構（如FDA）的疫苗組負責，治療性藥品/疫苗由藥品組負責，并且在新冠疫情的特殊時期，部分國家和地區也成立了特別審評部門，例如歐洲藥品管理局（European MedicinesAgency，EMA）為新冠疫苗開發成立了COVID-19特別工作組（COVID-19 EMA Pandemic TaskForce，ETF），我國也成立了國務院聯防聯控機制科研攻關組疫苗研發專班專家組，對新冠疫苗的審批實行“統一指揮、提前介入、隨到隨評、科學審評”的原則，做好應急審批的工作。
3.1國內mRNA疫苗監管相關法規和指導原則
由于新型冠狀病毒肺炎疫情防控的應急工作需要，2020年8月，國家藥品監督管理局藥品審評中心（Center for Drug Evaluation，CDE）集中頒布了5個關于新型冠狀病毒預防用疫苗研發技術指導原則，涉及藥學研究、非臨床研究和臨床研究等多個方面（見表1）[29-33]。其中，《新型冠狀病毒預防用mRNA疫苗藥學研究技術指導原則（試行）》[30]主要針對非復制型mRNA疫苗藥學研制制定的技術指導意見，包括模板設計、質粒構建、生產工藝、制劑處方、質量特性及標準制定、穩定性研究、申報臨床階段的考量等多個方面。研發者需根據自身產品相關特點和屬性開展相應的研究，針對mRNA新冠疫苗的申報可與CDE提前溝通，進行申報資料的滾動遞交。截至2021年9月，艾博生物、斯微生物、麗凡達生物均已有新冠mRNA疫苗產品進入臨床試驗階段。
表1 國內mRNA疫苗相關技術監管文件
3.2國外mRNA疫苗監管相關法規和指導原則
2020年12月22日，WHO生物制品標準化委員會（WHO Expert Committee on BiologicalStandardization，ECBS）公開征求對《預防傳染病mRNA疫苗的質量、安全性及有效性評價的法規考慮要點》（Evaluation of the Quality, Safety andEfficacy of Messenger RNA Vaccines for the Preventionof Infectious Diseases:Regulatory Considerations）的修訂意見[34]，ECBS起草小組根據反饋的425條意見于2021年7月再次征求公共意見。該指導原則共有10章，從通用考量、特殊考量、mRNA疫苗生產及質控、非臨床評價和臨床評價等方面提出對mRNA技術的法規考量點。與前述CDE發布的《新型冠狀病毒預防用mRNA疫苗藥學研究技術指導原則（試行）》[30]不同的是，這份文件草案的范圍不僅限于包裝在LNPs 中的mRNA，還包括自擴增型mRNA（sa-mRNA）。同時，WHO明確表示，不應將文件草案視為僅針對新冠疫苗提供指導，并且概述了在適當情況下的具體考慮，以幫助申辦人開發多價mRNA疫苗或針對某些病原體改變現有疫苗株。因此，針對mRNA預防性疫苗的開發策略，該草案的適用范圍更廣，為申請人做全球申報時提供了很重要的參考依據。
FDA于2021年1月19日以及2021年10月1日分別發布了《COVID-19 公共衛生緊急事件期間藥品許可及細胞和基因治療產品的生產考慮》（Manufacturing Considerations for Licensed andInvestigational Cellular and Gene Therapy ProductsDuring COVID-19 Public Health Emergency）和《關于Comirnaty問答（COVID-19 mRNA疫苗）》[Q&Afor Comirnaty（COVID-19 Vaccine mRNA）]，對申請人在新冠相關mRNA疫苗申報時做出指導[35-36]。EMA也于2021年9月16日發布了《EMA 關于加速COVID-19治療和疫苗開發支持和評估程序的舉措》（EMA Initiatives for Acceleration of DevelopmentSupport and Evaluation Procedures for COVID-19Treatments and Vaccines）[37]，但這些舉措都僅限于與新冠疫苗相關的產品。見表2。
表2 國外mRNA疫苗相關技術監管文件
3.3其他相關法規和指導原則
mRNA具有的遞送系統通常包括LNPs、LPP等。在制劑的質量研究、藥代動力學、非臨床安全性研究方面，可以借鑒有關納米藥物指導原則。
此外，治療型mRNA疫苗是在體內通過表達特定蛋白，刺激機體產生特異性免疫反應，可借鑒基因治療產品相關的部分要求。但是，該類療法與基因治療產品的風險不同，目前國內外尚無先例可循，并不完全適用所有基因治療產品的技術要求，期待監管部門和企業共同努力，建立mRNA療法適用的監管要求和指導原則。
3.4mRNA疫苗的監管現狀
mRNA疫苗作為一種新興技術，目前暫無監管案例可循。在Moderna公司和輝瑞/BioNTech公司的mRNA新冠疫苗獲得FDA、EMA等監管機構緊急授權使用以來，EMA于2021年8月11日已發出相關警告：mRNA疫苗可能有更多危險副作用，這些癥狀包括多形紅斑、腎小球腎炎或腎臟炎癥、腎病癥候群等[38]。美國疾病控制與預防中心也發現，青少年群體中罕見的心臟炎癥，可能與使用了mRNA技術的新冠疫苗接種存在關聯。從疫苗臨床安全性角度出發，應持續監測產品上市后不良反應，以及對生理功能潛在的非期望作用，包括但不限于對中樞神經系統、心血管系統、呼吸系統等多方面的影響。由于mRNA疫苗供應需求的激增，疫苗生產場地遍布全球各地，在目前全球國際交通受限的情況下，監管機構對各個生產場地的現場核查挑戰無疑是巨大的。事實上，FDA授權新冠疫苗之前并沒有做批準前檢查；而對于部分原液及重要輔料，包括LNP的生產場地，也均未開啟GMP檢查。因此，從疫苗質量及生產角度出發，國內疫苗生產企業尚可派駐駐廠員監管，但對于全球其他國家/地區的生產場地，無疑需要遠程核查方式的進一步探索，包括檢查的頻次和內容均需要全球監管機構進行深入探究。
4、mRNA疫苗產業化存在的相關問題
由于產品特性、生產工藝的原因，mRNA疫苗產業化存在多方面挑戰。包括：
4.1疫苗的可及性
現有mRNA疫苗對冷鏈運輸要求較高，例如Moderna公司和BioNTech公司開發的2種mRNA新冠疫苗分別需要在-15～-25℃和-60～-90℃的條件下進行儲存和運輸，較高的運輸成本無疑給疫苗的跨國供應帶來困難。可以通過持續的工藝優化穩定遞送系統的包封率提高產品的穩定性，開發耐熱性更好的疫苗。
4.2mRNA疫苗的生產管理及質量控制
從質粒生產、體外轉錄中復雜物料體系的混合和控制（包含多種酶的參與）、遞送系統裝載時mRNA-LNP的純化工序以及生產過程中各級中間產品/成品的質量評價，mRNA疫苗生產時所面臨的挑戰貫穿于各個環節，都需要在疫苗完成最初的結構設計之后對工藝進行持續的優化和質量的提升[39]。
4.3防止共線生產導致的系統污染風險
由于國際生產產能緊缺以及已上市品種數目較少的原因，尚無產品存在共線生產的情況。但是，由于mRNA疫苗模塊化、平臺化的生產特點，未來，新mRNA疫苗的生產將很有可能采用同一生產車間或生產線，如何建立全封閉mRNA疫苗生產方式，以及對清潔驗證的挑戰是企業必須要提前思考的問題。
4.4開發擁有自主知識產權的mRNA疫苗
核酸遞送系統、基因修飾、加帽技術是mRNA開發的幾個高壁壘，其核心專利仍掌握在少數幾家企業手中，因此，mRNA技術在中國的產業化落地必須考慮可能面臨的知識產權風險。
4.5新出現病毒變體的疫苗開發
病毒基因組在復制時常常會發生突變，新型冠狀病毒尤其如此。目前，正處在早期開發階段的新冠mRNA疫苗研發單位均已開始針對各類病毒突變株進行研究，CureVac公司也于2021年10月宣布退出其第一代COVID-19候選疫苗的開發，轉移到二代疫苗的開發上。從長遠角度來看，能夠開發一種預防新冠病毒和其他未來冠狀病毒的泛冠狀病毒疫苗非常重要?？梢葬槍Σ煌跔畈《局械谋Ｊ匚稽c，加快抗原發現和疫苗設計。
5、結 語
由于mRNA設計和核酸遞送技術數十年來的發展，這些多方面的技術創新結合在一起，克服了mRNA疫苗生產方面的諸多挑戰，促進了簡易、有效、靈活機動、可擴大化的平臺化合成流程的誕生。目前，輝瑞制藥公司/BioNTech制藥公司的新冠疫苗已于2021年8月獲得FDA的正式批準（16歲以上人群）[40]，Moderna公司也已完成FDA的生物制品許可申請。我國自COVID-19疫情發生以來，涌現了多家基于mRNA技術的新銳公司，但是到目前為止，國內尚無已批準上市的mRNA疫苗產品，除了復星醫藥引進BioNTech公司的mRNA疫苗產品外，我國多家公司的mRNA產品均處于臨床或早期開發階段。如前文所述，作為一種新興技術，使用mRNA作為疫苗/療法仍然面臨諸多挑戰，仍需克服mRNA開發核心技術的高壁壘。同時，對監管機構而言，與產品特性相匹配的相關法規和技術指導原則仍有待完善。隨著生物技術的飛速發展，相信在不久的將來，基于mRNA技術的產品將在生物制品領域占有重要的地位。本文對近年來mRNA技術的應用領域、mRNA疫苗的設計和特點，并結合國內外監管情況進行綜述，探討該平臺產業化應用目前存在的一些關鍵問題，以期為國內此類產品的開發提供參考。
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本文作者孫程潔、成殷、王沖，上海藥品審評核查中心，來源于中國藥事，僅供交流學習。
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