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嘉峪檢測網 2025-02-25 18:30
隨著生物技術的飛速發展，疫苗在預防和控制傳染病方面的作用越發顯著，廣泛的疫苗接種對全球健康至關重要。然而，在中等及低收入國家，要提高疫苗接種覆蓋率還存在重大挑戰。由于液體疫苗存在易分解、熱穩定性差、冷鏈配送成本高昂等不足，限制了疫苗在這些地區的分發和接種，使一些傳染性疾病在偏遠地區得不到有效控制。為了保證疫苗的穩定性和有效性，冷凍干燥（freeze-drying，FD）技術成為疫苗制備和保藏的關鍵技術之一。從冷凍干燥技術的原理、影響因素、FD技術在不同類型疫苗中的研究以及未來發展趨勢等方面進行了全面、系統的綜述，以期為疫苗研究和疫苗產業化的進一步發展提供有益的信息和思路。
疫苗在傳染病的預防和控制中發揮著重要作用。然而，疫苗的穩定性給疫苗的使用帶來極大的挑戰，在疫苗的儲存和運輸過程中，溫度、濕度、機械應力等多種因素都可能導致疫苗效力的下降或失活［1］。注射是疫苗接種常用的方法，因而疫苗通常制備成水溶液形式。然而，液體疫苗存在易水解、穩定性差、保存期短且需要冷藏等劣勢。固態疫苗在一定程度上抑制了疫苗的不穩定性，既保留了原有的生物活性［2］，又具有良好的再水化能力，便于儲存和運輸。傳統的干燥方法，在干燥過程中易造成疫苗活性的降低，因此在20世紀50 年代，科學家們開始采用冷凍干燥（freeze-drying，FD）技術［3］。FD 技術可以有效克服疫苗中抗原成分的熱力學不穩定性，為疫苗制劑提供了一種有效的制備方法，以保證制劑制備和儲存中物理化學性質的穩定，是目前常用的生物制品干燥方法［4］。FD 技術通過溶劑凍結和干燥兩個過程實現物質的干燥，冷凍干燥后的疫苗能在常溫下有效保存，有利于疫苗的儲存和運輸。目前，FD技術已在多種生物制品（包括疫苗）研發中得到廣泛應用。本文旨在對 FD 技術在疫苗制備中的原理、影響因素、疫苗制備的研究進展進行綜述，以期為FD技術在推動疫苗研發、改進疫苗儲存和使用條件，及未來疫苗的接種和疾病預防方面提供更可靠的支持和保障。
1.冷凍干燥技術
冷凍干燥技術（FD）指將液態物質凍結，并在真空條件下，將凍結的水分直接從固態轉變為氣態，從而去除樣品中的水分。FD技術可以有效地保留原材料的物理、化學、生物學特性，同時延長保存期限，在醫藥、食品、生物技術等領域應用廣泛。相較于傳統的干燥方法，FD被認為是一種較為溫和的方法。傳統的干燥方法在去除物質中的水分時，會使用較高熱量，易使溫度敏感的成分失活，而FD則通過低溫固態條件下去除水分，同時有效地保留產品的結構和活性成分。FD技術過程包括樣品預處理、冷凍、主干燥、次干燥和包裝等步驟。
1.1FD技術的原理
FD過程可以分為冷凍階段、主干燥階段和次干燥階段。在冷凍階段，物質中的水由液態變為固態。在主干燥階段，在真空泵的作用下系統內部產生低壓環境，樣品中的冰晶會直接經歷升華，由固態變為氣態，冰晶在較低的溫度下升華，從而減少樣品常溫干燥降解變性的風險。在次干燥階段，進一步去除殘留的水分或其他溶劑，以確保樣品或產品的徹底干燥和穩定［5］。次干燥有助于提高產品的儲存壽命，減少微生物生長的可能性，有利于長期保持產品的質量［6］。
1.2FD技術的影響因素
FD 技術是疫苗制備過程中最實用的干燥技術之一，能夠制備出高穩定性的凍干樣品，尤其適合處理不耐熱材料。然而，FD技術的最終產品受到多種因素的影響，包括凍干過程中的冷凍溫度、冷凍速度、初級干燥條件、次級干燥條件以及樣品配方選擇。通過對這些因素進行優化，能夠進一步提高凍干產品的質量和穩定性。
1.2.1 冷凍溫度
冷凍溫度對疫苗樣品中水分子的結構和運動狀態具有重要影響。選擇適當的冷凍溫度是FD過程的關鍵初始條件。FD通常要求將樣品冷凍至低于玻璃化轉變溫度（glass transi?tion temperature，Tg）。Tg 是指材料在冷凍過程中轉變為玻璃態的溫度，而玻璃態溫度是非晶態聚合物的固有特性。在玻璃態溫度下，材料內部的物質無法流動或變形，類似于固體狀態。當溫度超過玻璃態溫度時，材料會變得柔軟并具有流動性。玻璃化溫度取決于樣品的組成和性質，不同樣品具有不同的玻璃化溫度。一般來說，疫苗的玻璃化溫度范圍在−40~−60 ℃之間，將樣品冷凍至低于玻璃化溫度可以減少凍結過程對樣品結構的破壞和水分的損失，有利于后續的干燥步驟和樣品質量的保持。此外，研究還發現，預冷凍溫度對某些細菌菌株干燥后的存活率具有重要影響。在使用磷酸緩沖鹽水溶液和山梨醇作為保護劑的情況下，對 AR113、AR307 和 WCFS1 菌株進行不同預冷凍溫度的試驗，結果顯示不同菌株在不同溫度下的預冷凍能夠實現最佳存活率。例如，AR113 菌株在−196 ℃的預冷凍溫度能夠獲得最高的存活率，而AR307和WCFS1菌株最佳的預冷凍溫度分別是−40 ℃和−20 ℃［7］。
1.2.2 冷凍速率
凍結速率可以影響樣品的結晶形態、溶劑的遷移和整體干燥時間。快速冷凍使樣品形成均勻分布的冰晶，有利于保持樣品的活性和質量。快速冷凍還能使樣品迅速從游離水中快速凍結為固態，減少熱變性并防止真空干燥過程中的起泡現象。但快速冷凍后，易造成后續升華形成小的空隙，導致升華速度較慢。有研究表明，通過控制較小程度的超冷冷卻、較慢的冷凍速率，可以實現最佳的冷凍條件，從而獲得最小總表面積的大冰晶，同時可以顯著縮短一次干燥時間，并獲得外觀和形態更好的凍干產品［8］。也有研究表明，慢速冷凍會導致冰晶的尺寸增大，從而增加樣品中凍結損傷和溶解損傷的風險。此外，慢速冷凍還會導致溶液中溶質的濃度變化，可能對樣品的穩定性產生負面影響。緩慢冷凍形成的大冰晶和空隙，具有較小的表面積，導致在初級干燥期間質量傳遞阻力降低、干燥速度加快。但是大的孔隙尺寸減少了可用于非冰凍溶劑擴散的表面積，在次級干燥階段又會限制解吸速率，不利于熱傳遞［9］。
1.2.3 初級干燥過程中的真空度、溫度和時間
與冷凍階段相比，初級干燥階段的真空度、溫度和時間對凍干產品的最終質量具有重要影響。初級干燥是在低溫低壓條件下進行的，通過提供適當的低壓和足夠的熱量，以實現凍結的結晶水的升華并去除。這一步驟主要包括降低腔室壓力（chamber pressure，Pc）和逐步提高托盤溫度（shelftemperature，Ts），但保持樣品在 Tg 或臨界溫度（critical temperature，Tc）以下，且壓力應低于目標溫度下冰的蒸汽壓力，以保證樣品的質量和外觀［10］。FD 過程中真空度和干燥溫度是重要的影響因素，會影響 FD 產品的凍干時間和設備能耗，適當的干燥溫度可以促進傳熱和促使冰晶升華，適當的低真空度可以提供足夠的氣壓差和真空吸力，加速水分的脫除。然而，過低的真空度會導致水分子升華速度減慢，干燥過程變慢，整個 FD 過程的時間延長，從而增加能耗。而過高的真空度可能會給真空泵和其他設備帶來過度負荷，影響設備的壽命和性能，并降低傳統FD中樣品的氣流傳熱效率，反而降低了升華效率。
1.2.4 次級干燥中的真空度、溫度和時間
在次級干燥階段，通過蒸發使殘留在樣品中的水分子和構成抗原水合層的水分子去除。通常，在次級干燥中，貨架溫度要高于初次干燥，而壓力則要低于初次干燥壓力。由于濕度的逐漸降低，冷凍濃縮物的玻璃化轉變溫度也會逐漸增加。因此，為了節省時間和防止樣品的聚集，溫度可以逐漸升高（但必須低于Tg），以提高干燥效率［11］。Assege?hegn 等［12］以費森尤斯卡比公司的藥物配方為案例，優化了 FD 過程中的次干燥步驟，并研究了干燥溫度、干燥時間、小瓶位置和腔室壓力對含濕量和玻璃化轉變溫度的影響。結果顯示，在較短的干燥時間內，干燥溫度對樣品含水量和玻璃化轉變溫度的影響較大，增加干燥溫度可以顯著縮短達到設計含水量和玻璃化轉變溫度所需的干燥時間。腔室壓力從 0.05~0.40 m 的變化對含水量和玻璃化轉變溫度的影響微乎其微。研究還發現，在次級干燥中，瓶子的熱質量在干燥物的溫度上起著主要作用，約有 95% 的熱量被瓶壁吸收，從樣品表面解吸出的結合水分子的過程只受到溫度的影響［13］。
1.2.5 配方
樣品的配方是影響 FD 的關鍵因素之一。在FD中，配方的組成和濃度會影響樣品的穩定性，配方的選擇會直接影響凍干樣品最終的質量特性。選擇適當的冷凍保護劑，如蔗糖、海藻糖、乳糖等多糖類物質，可以減輕凍結和干燥過程中疫苗活性的損失。此外，在 FD 過程中，應充分考慮疫苗和凍結保護劑的濃度及比例，以達到最優保護效果。在新型冠狀病毒（corona virus dis?ease 2019，COVID-19）mRNA 脂質納米顆粒（lipidnanoparticle，LNP）疫 苗 的 優 化 研 究 中 ，Meule?waeter等［14］發現脂質體和核酸的配比顯著影響凍干后 mRNA 疫苗的封裝效率。尤其是當脂質：mRNA 質量比為 20∶1 時，凍干后的 mRNA 疫苗的封裝完整性達到最佳狀態。另外，在凍干過程中使用優化的輔料（如 Tris 或磷酸鹽以及 12.5 mol·L−1蔗糖）可以使凍干的 mRNA 疫苗達到最佳熱穩定性，在 4、22 和 37 ℃條件下，至少可以保持 12 周，而免疫效果無明顯變化。
目前，小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）被認為是一種有希望治療慢性乙型肝炎的方式，有望達到潛在的治愈效果。Huang 等［15］開發了一種名為 RBP131的新型可離子化脂質納米粒子以及先進的 siRNA 凍干技術，用于將針對載脂蛋白 B（apolipoprotein-B，Apo-B）的 siRNA 輸送至肝細胞。他們利用FD技術對RBP131/siRNA脂質體制劑進行處理，通過調整凍干條件，使用蔗糖作為保護劑，建立了一套優良的凍干工藝。經過凍干的 RBP131/siRNA 脂質體可以在−20、4或25 ℃條件下儲存，并且在1、2、3和4周后重新溶解，其外觀、封裝率、粒徑、聚分散指數和電位等質量控制參數與液體制劑一致，可滿足臨床應用期間的儲存和運輸需求。Chen等［1］在多種配方中篩選出一種重組靶向腫瘤的天花病毒疫苗（recombi?nant tumor-targeted vaccinia virus expressing ovalbu?min，rTTV-OVA）和腺病毒疫苗（adenovirus serotype5 expressing envelope protein， Ad5-ENV）凍干配方，包括牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、L-谷氨酸（L-Glu）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和右旋糖酐（dextran，DEX），旨在提高疫苗的熱穩定性和活性。通過比較 5 種不同的配方，發現配方#2（PEG∶DEX∶BSA∶L-Glu=50∶5∶4∶0）和#3（PEG∶DEX∶BSA∶L-Glu=50∶10∶9∶0）在 4 和25 ℃的溫度下能保持 rTTV-OVA 的免疫反應性，并且 rTTV-OVA的免疫原性在凍干過程中得到保留。配方#4（PEG∶DEX∶BSA∶L-Glu= 50∶0∶0∶9）和#5（PEG∶DEX∶BSA∶L-Glu= 50∶1∶0∶8）在相同的條件下保持了Ad5-ENV的感染性，而Ad5-ENV的免疫原性在凍干配方#4 中得到了最大程度的保留。Matejtschuk等［16］通過比較緩沖液中是否添加氯化鈉（通常被認為是凍干不利因素）對白細胞介素-6參考物質凍干的影響，發現配方對凍干生物制品至關重要。磷酸鹽緩沖液是首選，可獲得良好的生物活性。默克公司研發的口服輪狀病毒疫苗 RotaTeq®具有良好的熱穩定性，Madan 等［17］使用 RotaTeq®疫苗，進一步開發出一種安全有效耐熱的凍干配方 HSRV04D5，這種配方在 5 ℃下可穩定儲存超過 36 個月，在 37 ℃下穩定儲存 20個月，在45 ℃下穩定儲存7個月，能在高溫環境中進行儲存和運輸，同時復溶后能夠保持良好的疫苗效力。他們發現這種特性可能源于其 Tg 溫度為 61 ℃，這一溫度遠高于疫苗制劑的儲存溫度。由此推測，HSRV04D5配方的穩定性與其 Tg屬性直接關聯。凍干產品的儲存溫度應盡量低于凍干制劑的 Tg，且配方的 Tg 值越高，越有利于提高疫苗的熱穩定性。
1.3新型FD技術
凍干技術在疫苗等生物制品領域得到了廣泛應用。作為制造固體生物制品的主要手段，凍干具有許多優勢。然而，凍干也存在著周期長、能耗高和資金投入大等問題。為了克服這些難題，研究人員進行了大量的探索，開發出許多創新的凍干技術。雖然有些技術尚未在無菌疫苗方面得到廣泛應用，但其中一些技術，如旋轉凍干、噴霧冷凍干燥、薄膜冷凍干燥和微波輔助冷凍干燥，進一步改善了向連續生產方式的轉變。這些創新的凍干技術有望提高生產效率、降低成本，并為疫苗的生產帶來更多的機遇。圖1展示了幾種冷凍干燥技術類型。
圖1 各冷凍干燥示意圖
1.3.1 旋轉冷凍干燥
旋轉冷凍干燥（rotaryfreeze-drying，RFD）技術是一種將樣品放置在旋轉容器中，使待凍干的樣品在離心力作用下貼到容器側壁進行冷凍干燥的方法。這種方法的優點是凍干固體的比表面積大，干燥速度快，能更好地保持樣品的理化結構和生物活性。
Meyer等［18］對5種不同配方進行了測試，在所有的配方中，旋轉冷凍瓶的升華速率顯著提高。Leys等［19］采用在線過程分析技術對連續冷凍干燥流程進行了優化，通過控制冷卻速率和凍結速率來控制凍結階段，控制瓶溫度（從而控制產品溫度）到設定值并監測殘余水分來控制干燥階段。在凍結階段，瓶溫度隨冷卻階段設定溫度下降，并且可以通過調節凍結速率來控制結晶相。在初級和次級干燥階段，瓶溫度保持在設定溫度上，每次運行后樣品都能保持良好的結構。Meulewaeter等［14］探索了一種基于旋轉冷凍的新型連續冷凍干燥技術，與經典的批量冷凍干燥技術相比，該技術具有干燥時間短、流程簡便和產品質量更好的優點。在此項研究中，采用了較高的脂質含量，其中mRNA和輔料（Tris或磷酸鹽以及12.5 g·L−1蔗糖）質量比為 20∶1，經過最佳凍干處理的 mRNA 疫苗，在4、22和37 ℃下，其活性在12周內未發生變化。同時，也有研究人員將旋轉冷凍工藝和傳統凍干工藝相結合，發明了一種新型的連續冷凍干燥工藝，用于制備單劑量產品［20］。這種連續冷凍干燥技術的一個主要特點是瓶裝液體產品沿著縱軸旋轉，因此也被稱為旋轉冷凍干燥。由于凍結產品遍布在瓶子內壁上，可以產生較大的表面積，從而使得分散層的冷凍/加熱快速且均勻，總處理時間根據瓶子尺寸和產品配方的不同，可以比傳統的冷凍干燥時間縮短10~40倍。
1.3.2 噴霧冷凍干燥技術
為了進一步增加凍干物質的比表面積，提高凍干效率，研究人員將噴霧冷凍和動態冷凍干燥技術結合，創造出了噴霧冷凍干燥技術（spray freeze drying，SFD）［21］。該技術采用頻率驅動的噴孔噴嘴進行噴霧過程，液體進料以共振頻率分解為圓形液滴，通過自身重力引導進入冷凍室。在冷凍室中，液滴與−80~−150 ℃的氮氣進行熱量交換，形成大小為 300~1000 μm的均勻凍結球體。凍結后的微球根據真空閘門的開閉情況，批次進入旋轉冷凍干燥機。旋轉冷凍干燥機通常采用多個轉盤或軸，每次處理一批噴霧冷凍干燥的物料后，切換至下一個轉盤或軸進行處理。通過這種方式，實現了大批量樣品的連續冷凍干燥，顯著提高了可持續的凍干效率。
白藜蘆醇（resveratrol）是一種多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗衰老和心血管保護等多種生物活性。然而，在鼻內給藥時，白藜蘆醇的溶解度低，且易被鼻腔清除，導致其生物利用度有限。為了克服這一問題，Di等［22］以羥丙基-β-環糊精作為絡合劑和輔料，殼聚糖作為粘附增效劑，采用噴霧冷凍干燥技術制備了均勻的微粒。實驗結果表明，所獲得的粉末與純白藜蘆醇相比，溶解度顯著提高了 1 800倍，并具有優異的抗氧化活性。Shokouh 等［23］利用 SFD 技術，通過添加糖（甘露醇或海藻糖）和氨基酸（亮氨酸、苯丙氨酸或絲氨酸），成功制備了雷扎替坦苯甲酸鹽微粒。這些配方能有效噴霧化，并提供了高達 61.1% 的可接受細顆粒分數（fine particle fraction，FPF）。特別是由海藻糖和苯丙氨酸組成的噴霧凍干粉末表現出最佳的吸入性能（FPF = 61.1%），表明這些球形多孔微粒具有良好的分散性能，減少了粘附和聚集。這些結果成功證明，雷扎替坦可以制備成可呼吸微粒，成為一種有希望用于快速和有效控制偏頭痛發作的給藥系統。Qiu 等［24］開發了 mRNA治療或預防一系列肺部疾病的技術，其通過噴霧冷凍干燥技術，將 PEG（12）KL4 和 mRNA 復合物干燥后，制備成干粉劑，這種干粉劑有較高的吸入性能，其活性也得到了很大程度地保留。Mutukuri等［25］考察了SFD牛血清白蛋白固體的物理穩定性，與傳統凍干技術相比，SFD技術在保持或提高牛血清白蛋白物理穩定性的同時，可顯著縮短其凍干周期。Pan 等［26］通過 SFD 將 IL-4受體的單克隆抗體制劑制備成干粉后，通過吸入途徑用于重度哮喘的治療。SFD 技術在制劑方面的應用，展現出令人滿意的氣溶膠性能，實現對抗體的脫水，同時抗體的中和活性未受影響，即使在常溫環境下存放一年后，抗體仍保持穩定的理化性質和生物學活性。銅綠假單胞菌的多藥耐藥性是囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）患者終末期和持久性肺部感染的主要原因。Yu等［27］組成伊伐卡托∶粘菌素∶DSPG-PEG-OMe質量比為1∶1∶1的配方，使用超聲噴霧冷凍干燥方法開發了干粉劑，該配方對于難溶于水的伊伐卡托的溶解改善效果非常顯著，將2種藥物合并在一個微粒中，其同步溶解和良好的氣霧劑性能，最大程度地提升這2種藥物的協同作用和生物活性。
1.3.3 微波輔助冷凍干燥
微波輔助冷凍干燥（microwave-assisted freeze-drying，MFD）是一種在冷凍干燥過程中使用微波輻射加熱的方法，用微波真空冷凍干燥技術來提高樣品的凍干干燥效率。與冷凍干燥相比，干燥速度更快，能量消耗更低，可以更好地保持樣品的結構和活性。Wang等［11］通 過 MFD 方 法 來 生 產 蛋 黃 免 疫 球 蛋 白（IgY），研究了 FD 和 MFD 對不同含量海藻糖的IgY 的免疫活性和結構的影響。結果顯示，冷凍干燥導致 IgY 中部分二級結構的損失，從而導致活性損失。隨著海藻糖含量從0增加到5%，MFD樣品的活性保留率從 20.31% 增加到 75.57%，與FD樣品（從23.57%增加到67.78%）相當。與傳統FD 相比，MFD 的干燥周期較短，更具優勢。Doreth等［28］通過MFD技術制備了吲哚美辛-聚乙烯比咯烷酮 k12 非晶固體分散劑。吲哚美辛-聚乙烯比咯烷酮 k12 非晶固體分散劑不會因 MFD 的影響而發生降解，并且形成非晶片劑的溶解速度比之前高6倍。Gitter等［29］研究了2種單克隆抗體的4種配方，發現 MFD 能夠顯著縮短干燥時間，未發現相關性質及穩定性降低的情況，并且批次保持了良好的均一性，體現出了 MFD 在抗體中的應用潛力。Hardter 等［30］使用 MFD 研究了 6 種單克隆抗體（mAb）制劑在干燥后的質量和儲存6 個月后的穩定性，發現 MFD 的干燥過程較傳統的 FD 干燥大大縮短，并且可控性良好，沒有出現任何等離子放電的跡象。此外，凍干品的表征顯示出良好的形狀，且在 MFD 后的 mAb 中具有良好的穩定性，MFD 技術已成功制備出 mAb 制劑產品。
1.3.4 薄膜冷凍干燥
薄膜冷凍干燥（thin-filmfreeze-drying，TFFD）是一種將液體或溶解的物質直接凝固成薄膜，并在低溫下進行冷凍干燥的過程，這種方法可以避免傳統冷凍干燥過程中的物質結塊問題，提高干燥速度和效率。Yu等［31］使用含有脂質體單磷脂 A 和 QS-21 佐劑（AdjLMQ）以及卵清蛋白（ovalbumin，OVA）作為模型抗原的疫苗，通過 TFFD 方法將含有蔗糖和脂質的液體疫苗成功轉化為干粉，其中蔗糖與脂質的比例為15∶1（質量比），并考慮了羧甲基纖維素鈉鹽（carboxymethylcellulose，CMC）等粘附劑的存在與否。最終，選擇了含有1.9%（質量分數）CMC的TFFD AdjLMQ/OVA 疫苗干粉進行進一步評估，運用 Taguchi L4正交表來確定鼻腔噴霧設備在成人和兒童鼻腔模型中將 TFF AdjLMQ/OVA/CMC1.9% 干粉送達至中下鼻腔和鼻咽區域的最佳參數。研究結果表明，通過 TFFD 技術將鼻疫苗從液體轉化為干粉，并使用鼻腔噴霧包裝形式將干粉送達至鼻腔中的目標區域進行鼻內接種。Hufnagel等［32］配制了 PD-1 IgG 與乳糖/亮氨酸（60∶40，質量比）或海藻糖/亮氨酸（75∶25，質量比）的配方，在磷酸鹽緩沖液中，制劑經TFFD處理后，產生的干粉具有理想的噴霧性能，TFFD干粉具有多孔的結構和納米聚合物的特性，并且 Tg介于 39~50 ℃。當在室溫下儲存時，TFFD制備的干粉中抗體具有比液體配方更高的穩定性。Aboul等［33］利用 TFFD 技術，采用海藻糖作為穩定劑，成功地將含 AddaVax 佐劑（一種水包油納米乳化疫苗佐劑）的 Fluad（R）四價流感液態疫苗轉化為干粉，抗原的完整性和血凝活性并未發生顯著變化。此外，在小鼠模型中，重組流感疫苗的免疫原性保持不變，且干粉對重復凍融過程并不敏感，具有良好的穩定性，TFFD技術有望用于制備多價流感通用疫苗干粉。
1.4凍干技術的優化
凍干技術是一項復雜的工藝技術，優化凍干技術，可以從設備和材料選用、凍干過程參數控制、產品配方優化、儲存條件優化這幾方面提高凍干技術的效果。不同的物料可能需要使用不同的凍干設備，例如對于熱敏性物料，需要選用能夠精確控制溫度和真空度的設備。同時，選用高品質的材料可以有效提高產品的包裝質量和存儲條件［34］。凍干過程中的溫度、真空度、凍干時間等參數都需要進行精細化控制，這需要依賴于先進的設備和智能化的控制系統。通過實時監測和調整這些參數，可以確保物料的凍干效果達到最佳［35］。通過調整物料的配方，可以有效提高凍干產品的活性和質量。Guo等［36］在制備高載量胰島素納米顆粒時，通過優化配方發現，不添加甘露醇的噴霧干燥或凍干脫水納米顆粒比添加甘露醇的納米顆粒載藥量更高，同時具有更小的平均顆粒，更有利于胰島素釋放，細胞攝取效果更好。合理的存儲條件可以延長產品的保質期，保證產品的品質和使用效果，這需要對溫度、濕度、光照等環境因素進行嚴格控制。通過這些優化措施，可以進一步提高凍干技術的生產效率和產品質量，降低生產成本，得到質量更好、儲存期限更長的凍干產品。
2.不同類型疫苗的冷凍干燥研究
液體疫苗制劑受多種因素（如溫度變化、氧化和水解等）影響，易造成活性降低。而凍干技術，可以將液體疫苗轉化為干燥粉末形式，能夠避免或抑制許多降解途徑的發生。在干燥制劑中，特別是無水或含水量較低的情況下，疫苗制劑的穩定性可以得到顯著提高。相比于液體疫苗，干燥疫苗制劑具有許多潛在的優勢，包括更長的貨架壽命和較寬松的冷鏈存儲要求，這有助于減少疫苗儲存和運輸的成本，拓寬疫苗的接種區域。
2.1滅活疫苗
滅活疫苗是一類使用滅活的病原體制備的疫苗，具有較高的安全性，冷凍干燥技術可以提高病毒滅活疫苗的穩定性，減少在運輸和儲存過程中的損失。Abd等［37］對包含牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）1和2型、牛單純皰疹病毒 1.1 型（BoHV-1.1）、牛副流感病毒（bovineparainfluenza virus，BPSV）3型和牛呼吸道合胞病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）5 種滅活病毒的 Pneumo-5 合并病毒滅活疫苗進行了凍干處理，并對小鼠和小牛進行了無菌性、安全性和效力評估。研究結果表明，制備的Pneumo-5疫苗凍干制劑能夠保護小牛對抗 BVDV 1 型、BVDV 2型、BoHV-1.1、BPI-3V 和 BRSV 病毒，且具有安全性和有效性。然而，由于滅活疫苗在滅活過程中已經對疫苗抗原造成了一次活性降低作用，滅活疫苗中通常加有佐劑以提高抗原對機體的免疫效果［38］。在凍干的過程中，由于工藝復雜，可能使疫苗抗原的活性再次降低，佐劑結構有可能發生變化，從而降低疫苗的免疫效果，因此目前大部分滅活疫苗，是以液體形式保存，而使用凍干技術較少。
2.2減毒活疫苗
減毒活疫苗是一類使用減毒的病原體制備的疫苗，能夠誘導強烈的免疫反應，產生多種抗體，并且具有長久的免疫效果。冷凍干燥技術可以提高減毒活疫苗的穩定性，減少在運輸和儲存過程中的損失。
研究人員在處理某些新分離的呼吸道病毒時發現在低于−60 ℃的條件下，一些流感病毒和鼻病毒制劑與 2% 的牛血漿蛋白或 2% 的小牛血清共存一年甚至更長時間后會失去傳染性。此外，這些冷凍的流感病毒在室溫下會很快失去傳染性，因此必須以冷凍狀態或作為感染的組織培養物進行傳輸，這給實際的研究過程帶來了極高的條件限制。Tyrrell 等［39］通過優化冷凍干燥條件，提高了病毒的穩定性，進一步證明了冷凍干燥技術在冷凍保存具有潛在傳染性病毒中的重要作用。另外，Abayneh等［40］研究發現炭疽凍干疫苗在20 ℃儲存條件下，可以在180 d 內保持較高效力，而液體懸浮疫苗的儲存時間僅為 90 d。Shokri等［41］探索了 2 種新型穩定劑（海藻糖穩定劑和包含蔗糖、人血清白蛋白、山梨醇的穩定劑）對冷凍干燥活病毒風疹疫苗（高橋株）的熱穩定性，并與商用的明膠穩定劑配方作對比。不同穩定劑制備并進行凍干處理后的樣品，通過加速穩定性測試評估了所產生的疫苗的效力。結果表明，與商業風疹疫苗中含有明膠穩定劑和蔗糖穩定劑的配方相比，海藻糖的穩定劑凍干疫苗表現出充分的穩定性。Jamil 等［42］制備并評估了冷凍干燥的減毒腮腺炎活疫苗，發現在加速穩定性實驗中即使在最嚴苛的37 ℃條件下存儲一周，Vero細胞50%的細胞培養感染量（50% cell culture infectious dose，CCID50）下降幅度不到 10 倍，符合當時世界衛生組織對弱毒性腮腺炎活疫苗效力的要求。
在日本，凍干減毒活皰疹-帶狀皰疹病毒疫苗可供≥50 歲的成年人使用，以預防帶狀皰疹。Matsumoto 等［43］對 1200名健康成年人和 300名患有基礎疾病的患者進行了疫苗安全性確認，并分析了 2016—2017 年之間 1098 名接種者和 518 名未接種者在 2016—2022 年間的發病率。結果顯示，無論年齡、性別或有何合并癥，凍干減毒活皰疹-帶狀皰疹病毒疫苗都能降低被接種者患上帶狀皰疹的風險。Clenet等［44］對黃熱病毒疫苗進行了冷凍干燥研究，發現冷凍干燥后的樣品具有較高的 Tg，確保了良好的斷裂力和高抗潰散性。在為期3年的穩定性觀察期間，發現在冷藏條件（2~8 ℃）下，這種干燥微粒的黃熱病毒感染滴度與冷凍干燥產品相似。在 25℃和 37℃的加速穩定性研究中，微粒中的 vYF 的降解動力學與常規凍干產品無顯著差異，這些結果揭示了將減毒活病毒疫苗制成微粒形式的巨大潛力。
Madan等［17］利用默克公司的凍干輪狀病毒減毒活疫苗 RotaTeq®，開發出了一種安全、有效、耐熱的凍干配方（HSRV04D5），在 5、37和 45 ℃條件下，根據實時穩定性數據的線性回歸分析得出，HSRV04D5 在 5℃下，穩定性超過36個月，在37 ℃下可達到 20 個月，在 45 ℃下可達到 7 個月，穩定性研究結果顯示出凍干輪狀病毒減毒活疫苗有極佳的熱穩定性。此外，他們還發現這種穩定性的特性可能源于其Tg溫度為61 ℃，這一溫度遠高于疫苗制劑的儲存溫度。由此推測，HSRV04D5配方的高度穩定性與其Tg值直接關聯。凍干產品的儲存溫度應盡量低于凍干制劑的Tg值，且配方的Tg值越高，越有利于提高制劑的熱穩定性。
2.3亞單位疫苗
亞單位疫苗是由病原體的一個或多個組分（如蛋白質、多肽或多糖）構成的疫苗。這些組分可以通過化學方法從病原體中提取，或通過基因工程方法在宿主細胞中表達。由于它們不含具有復制功能的病原體，通常亞單位疫苗比減毒活疫苗和滅活疫苗更安全。同樣，冷凍干燥技術可以提高亞單位疫苗的穩定性，延長其有效期。Kelly等［45］通過冷凍干燥技術制備了舌下免疫途徑的結核分枝桿菌的超分子肽疫苗，通過舌下免疫可產生針對結核分枝桿菌 ESAT6 表位的抗體反應。此外，該疫苗在45℃條件下儲存1周后進行免疫，舌下抗體反應并未減弱，證明其具有良好的熱穩定性。
水痘帶狀皰疹病毒（varicella zoster virus，VZV）是一種神經和淋巴病毒，可以引起水痘和帶狀皰疹（herpes zoster，HZ）。初次感染時，VZV 會導致兒童患上水痘，而潛伏在感覺神經節中的病毒會導致老年人出現疼痛的帶狀皰疹，并可能引發嚴重并發癥，如皰疹性神經痛。Wui 等［46］開發了一種名為 CIA09A 的新型脂質體佐劑系統，該系統由陽離子脂質體、Toll 樣受體 4（toll-like receptor 4，TLR4）激動劑去酰化脂質寡糖和坎拉查皂苷分離物（quillaja saponin fraction-21，QS-21）組成。將該脂質體佐劑與重組的VZV糖蛋白E（gE）一同凍干，并沒有破壞gE的免疫活性。該疫苗在誘導體液免疫和細胞免疫反應方面表現出極高的效果。此外，在接種疫苗的小鼠中，出現了干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α 和白細胞介素-2等細胞因子表達水平的顯著提高。這些數據表明，通過將蛋白抗原與 CIA09A 一起凍干制成的疫苗，能夠產生強大的細胞免疫，以提高疫苗的有效性。
2.4重組病毒載體疫苗
重組病毒載體疫苗是一種利用病毒載體將合成抗原的遺傳物質遞送至人體的疫苗。這種疫苗利用經過改造的無病原性病毒作為載體，將目標病原體的基因序列插入到病毒載體中，生成重組病毒。當接種重組病毒載體疫苗時，病毒載體進入人體細胞，并開始表達目標病原體的抗原，以引發免疫反應。人體能產生針對目標病原體的特異性免疫應答，提供對該病原體的保護。
扎伊爾埃博拉病毒（Zaireebolavirus，EBOV）是已知最致命的傳染病毒之一，人類感染病例的病死率高達 89%。自 2018 年 8 月起，默克公司的ERVEBO®重組水皰性口炎病毒-扎伊爾埃博拉病毒疫苗（recombinant vesicular stomatitis virus-ZaireEbola virus，rVSV-ZEBOV）一直被用于剛果民主共和國北基伍地區的埃博拉病毒疫情控制。該疫苗要求以冷凍固態形式存儲在−60 ℃至−80 ℃溫度下。解凍后，液體的 rVSV-ZEBOV 疫苗在 25 ℃下只能穩定一天，當天未被使用的疫苗即被丟棄。因此，將疫苗運送到偏遠地區，對于炎熱的低收入和中等收入國家來說是一項具有挑戰性的任務［47］。Preston 等［48］使用 9.5%（質量體積分數）的海藻糖（280 mol·L-1）作為保護劑，通過乙酸銨調節凍干過程中的離子強度，利用冷凍干燥技術處理埃博拉病毒糖蛋白（Ebola virus glycoprotein，EBOV-GP）亞單位疫苗，結果顯示這種凍干疫苗在高達 40 ℃下，可保存 12 周。通過對疫苗的物理特性研究表明，在高溫條件下，液體配方中EBOV-GP 的組裝狀態發生了變化，而在冷凍干燥的配方中，EBOV-GP的組裝狀態沒有受到影響。
2.5核酸疫苗
核酸疫苗是通過將病原體的核酸片段（如mRNA 或 DNA）注入人體，誘導細胞內表達病原體部分蛋白，從而引發體液免疫和細胞免疫的疫苗。經過多年的研究和開發，mRNA 遞送系統取得了突破性進展，mRNA 疫苗已成為預防新型冠狀病毒感染的領先技術。相比于滅活疫苗和重組蛋白疫苗，mRNA 疫苗能夠迅速更新，因此針對不斷出現的變異株，也具備強大的免疫效果。
mRNA 雖然具有獨特的優勢，但其物理化學的不穩定性仍然是限制疫苗使用的主要因素。目前，獲得批準的 2種 mRNA 疫苗，BNT162b2（儲存溫度為−80 ℃至−60 ℃）和 mRNA-1273（儲存溫度為−20 ℃），均需要在低溫下冷凍保存和運輸。這些嚴格的要求源于多種脂質成分之間復雜的相互作用，以及 mRNA 對氧氣、濕度、酶、pH 和其他條件非常敏感的不穩定性。Packer等［49］報道了離子化脂質的氧化和隨后水解副產物加速mRNA降解的新機制。由于水、氧和離子化脂質是mRNA-脂質納米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）溶液中常見的組分，因此在液態下實現高穩定性的 mRNALNP在理論上是很困難的。Ai等［50］通過凍干技術研發了具有長期熱穩定性的 SARS-CoV-2 mRNA脂質納米顆粒疫苗，結果發現凍干疫苗在25 ℃條件下保持了6個月的物理化學性質和生物活性的穩定性。這種凍干的 SARS-CoV-2 mRNA 疫苗能夠在小鼠、兔子和恒河猴等動物中誘導強大的體液和細胞免疫。此外，人類試驗也表明，使用凍干的 Omicron mRNA 疫苗作為加強劑能夠產生強大的免疫效應，并且沒有出現嚴重的不良事件。脂質修飾聚合物聚β-氨基酯通過酶催化酯化反應合成，并與聚乳酸-共-縮乙二醇自組裝成一種用于核酸遞送的“顆粒內顆粒”（particle-in-particle，PNP）納米結構。Li 等［51］在 24 種 PNP 候選者中篩選出最有效的 PNP/C12-PBAE 納米顆粒，這些顆粒在體外和體內均表現出高效的核酸遞送性能，具有增強的轉染效果、持久的基因釋放能力和出色的穩定性。在經過凍干后，這些 PNP 顆粒在−20 ℃的儲存條件下至少能保持12個月，且無需擔心轉染效果損失的問題。將攜帶刺突蛋白編碼質粒DNA 或 mRNA 的脂質修飾聚合物 PNP COVID-19疫苗封裝后，即使在−20 ℃凍干儲存12個月后，仍能成功激發免疫小鼠產生針對刺突蛋白的抗體和傾向于Th1型的T細胞免疫應答。因此，凍干技術不僅克服了核酸疫苗的不穩定性，同時保持了其生物學活性。
2.6病毒樣顆粒疫苗
病毒樣顆粒疫苗是由病毒的結構蛋白質組裝而成的顆粒疫苗，由于其結構與天然病毒相似，能引起很強的細胞免疫和體液免疫，但其不含病毒的遺傳物質，安全性更強［52］。冷凍干燥技術可以提高病毒樣顆粒疫苗的穩定性，降低運輸和儲存過程中的損失。例如，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）疫苗和乙型肝炎疫苗都采用了冷凍干燥技術。HPV 的衣殼次要蛋白質是 L2 蛋白，它存在于 HPV病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）中，位于每個五聚體的頂點。通過對 L2 蛋白 N-端衍生的多肽進行免疫化，可以誘導人體產生廣譜的抗體反應，從而產生能夠交叉保護多種HPV類型的抗體。Yadav等［53］開發了混合的MS2-L2病毒樣顆粒（包括MS2-31L2/16 L2 VLP和MS2-consL2（69-86）VLP）疫苗，并通過噴霧冷凍干燥技術制備得到。這種疫苗對于引起宮頸癌的大多數HPV 類型（約 95.8%）具有預防效果，并且對大多數引起生殖器疣和復發性呼吸道乳頭瘤病毒的HPV 類型（約 90%）也具有預防作用，且該凍干疫苗在 37 ℃條件下存放 10個月后仍能保持良好的免疫效果。另外，研究者還開發了一種二價諾如病毒疫苗，該疫苗中包含GI.1和GII.4亞型的諾如VLP，并吸附在鋁佐劑上。Xu 等［54］通過 TFFD 技術測試了將這種諾如病毒 VLP 疫苗從液體懸浮轉化為干燥粉末的可行性。他們使用經過優化的海藻糖或蔗糖作為保護劑，將疫苗進行凍干處理后，抗原的相對效力在可接受范圍內。在加速穩定性研究中，使用TFFD制備的凍干疫苗在40 ℃、相對濕度為 75% 的條件下儲存 8 周后，抗原的效力仍然保持在可接受范圍內。
2.7結合類疫苗
結合類疫苗是將病原體表面的多糖或蛋白質與載體蛋白質結合制成，以增強其免疫原性和免疫系統的反應性，從而提高對特定病原體的免疫效果。肺炎球菌結合疫苗（pneumococcal conjugate vaccine，PCV）在全球市場上尚未有凍干劑型，導致全球 PCV疫苗的分配范圍差距巨大。此外，目前獲得許可的 PCV疫苗僅針對一些與肺炎鏈球菌相關的血清型，而不是全部。Mensch等［55］開發了一種凍干佐劑的多價疫苗制劑，以符合肺炎球菌疾病的流行病學評估，并提供更廣泛的覆蓋范圍。他們從15個配方中篩選出最佳配方，以穩定凍干疫苗的效力。在配方中添加0.5%（質量分數）的丙二醇和 6%（質量分數）的甘露醇，并與 0.5%（質量分數）的羧甲基纖維素鈉和 4%（質量分數）的蔗糖一起使用，能夠有效控制凍干過程中疫苗效力的下降。相對于非凍干劑型，凍干的肺炎球菌結合疫苗在穩定性和免疫效果方面均表現出了良好的效果。
冷凍干燥技術在疫苗制造中的應用，可以大大提高疫苗的穩定性和便捷性，表1 匯總了一些凍干疫苗及穩定性能。
表1 凍干疫苗示例及穩定性
3.展 望
傳統液體疫苗需要在低溫條件下儲存和運輸，并具有短暫的保持時間，而冷凍干燥技術可以將疫苗凍干成干燥粉末，極大地延長了疫苗的穩定性和保質期。凍干疫苗可以在常溫下儲存和運輸，并且更容易配送到偏遠地區。此外，冷凍干燥的疫苗也更容易用于應急情況，方便大規模的疫苗接種。冷凍干燥技術具有適應突發疫情和全球疫苗需求的潛力。例如，在面對傳染病突發情況下，凍干疫苗可以穩定的供應到各個地區，滿足全球范圍內對疫苗的需求，特別是在資源有限的地區或偏遠地區，通過凍干疫苗的配送和儲存，能夠更好地滿足人類疫苗需求，對于控制疫情起到至關重要的作用。
參考文獻
［1］ CHEN Y, LIAO Q, CHEN T, et al.. Freeze-drying formulationsincreased the adenovirus and poxvirus vaccine storage timesand antigen stabilities[J]. Virol. Sin., 2021, 36(3): 365-372.
［2］ LYU J L, BAO L R, SHEN X, et al.. The preparation of N-IgYtargeting SARS-CoV-2 and its immunomodulation to IFN-gam?ma production in vitro[J/OL]. Int. Immunopharmacol., 2021,96: 107797[2021-06-25]. https://doi.org/10.1016/j.intimp. 2021.107797.
［3］ HARRIS R J. Preservation of biological materials by freezedrying[J]. Nature, 1951, 168(4281): 851-853.
［4］ WANG Z, LI L, REN G, et al.. A comprehensive review on sta?bility of therapeutic proteins treated by freeze-drying: inducedstresses and stabilization mechanisms involved in processing[J].Dry. Technol., 2022, 40(16): 3373-3388.
［5］ LIU Y, ZHANG Z, HU L. High efficient freeze-drying technol?ogy in food industry[J]. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 2022, 62(12):3370-3388.
［6］ FRANKS F. Freeze-drying of bioproducts: putting principlesinto practice[J]. Eur. J. Pharm. Biopharm., 1998, 45(3): 221-229.
［7］ WANG G Q, PU J, YU X Q, et al.. Influence of freezing tem?perature before freeze-drying on the viability of various Lacto?bacillus plantarum strains[J]. J. Dairy Sci., 2020, 103(4): 3066-3075.
［8］ SITAR A, ŠKRLEC K, VOGLAR J, et al.. Effects of controllednucleation on freeze-drying lactose and mannitol aqueous solu?tions[J]. Dry. Technol., 2018, 36(10): 1263-1272.
［9］ NUYTTEN G, REVATTA S R, VAN BOCKSTAL P, et al.. De?velopment and application of a mechanistic cooling and freez?ing model of the spin freezing step within the sramework ofcontinuous freeze-drying[J/OL]. Rmaceutics, 2021, 13: 2076[2021-12-29]. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13122076.
［10］ KAWASAKI H, SHIMANOUCHI T, KIMURA Y. Recent de?velopment of optimization of lyophilization process[J/OL]. J.Chem., 2019, 2019: 9502856[2019-05-05]. https://doi.org/10.1155/2019/9502856.
［11］ WANG Z, DUAN X, LI L, et al.. Effects of freeze-drying andmicrowave vacuum freeze-drying on the activity of IgY: fromthe perspective of protein structure[J]. Dry. Technol., 2023,41(2): 222-232.
［12］ ASSEGEHEGN G, FUENTE B D L, FRANCO J, et al.. Under?standing and optimization of the secondary drying step of afreeze-drying process: a case study[J]. Dry. Technol., 2021, 39(8): 1003-1017.
［13］ YOON K, NARSIMHAN V. Understanding heat transfer dur?ing the secondary drying stage of freeze drying: current practiceand knowledge gaps[J]. J. Pharm. Sci., 2022, 111(2): 368-381.
［14］ MEULEWAETER S, NUYTTEN G, CHENG M H Y, et al..Continuous freeze-drying of messenger RNA lipid nanoparti?cles enables storage at higher temperatures[J/OL]. J. Control.Release, 2023, 357: 149[2023-03-21]. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2023.03.039.
［15］ HUANG Y, ZHENG S, GUO Z, et al.. Ionizable liposomal siR?NA therapeutics enables potent and persistent treatment ofHepatitis B[J/OL]. Signal Transduct. Target. Ther., 2022, 7: 38[2022-02-12]. https:// doi.org/10.1038/s41392-021-00859-y.
［16］ MATEJTSCHUK P, BIRD C, EZEAJUGHI E, et al.. Impact offormulation choices on the freeze-drying of an interleukin-6reference material[J/OL]. Front. Mol. Biosci., 2022, 9: 868460[2023-12-20]. https://doi.org/10.3389/fmolb.2022.868460.
［17］ MADAN M, SIKRIWAL D, SHARMA G, et al.. Rational designof heat stable lyophilized rotavirus vaccine formulations[J].Hum. Vaccines Immunother., 2018, 14(9): 2132-2141.
［18］ MEYER L D, VAN BOCKSTAL P J, CORVER J, et al.. Evalua?tion of spin freezing versus conventional freezing as part of a con?tinuous pharmaceutical freeze-drying concept for unit doses[J].Int. J. Pharm., 2015, 496(1): 75-85.
［19］ LEYS L, NUYTTEN G, VAN BOCKSTAL P J, et al.. Evalua?tion of a PAT-based in-line control system for a continuous spinfreeze-drying process[J/OL]. Int. J. Pharm., 2023, 641: 123062[2023-05-21]. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2023.123062.
［20］ Method and system for freeze-drying injectable compositions,in particular pharmaceutival compositions: US201815922757[P]2019-03-01.
［21］ LUY B, STAMATO H. Spray freeze drying[M]//OHTAKE S,IZUTSU K, LECHUGA-BALLESTEROS D. Drying technolo?gies for biotechnology and pharmaceutical applications. Ameri?ca: John Wiley & Sons Ltd, 2020, 217-237.
［22］ DI A, ZHANG S, LIU X, et al.. Microfluidic spray dried andspray freeze dried uniform microparticles potentially for intra?nasal drug delivery and controlled release[J]. Powder Technol.,2021, 379: 144-153.
［23］ SHOKOUH M K, FAGHIHI H, DARABI M, et al.. Formula?tion and evaluation of inhalable microparticles of Rizatriptanbenzoate processed by spray freeze-drying[J/OL]. J. Drug Deliv.Sci. Tec., 2021, 62: 7[2019-05-05]. https://doi.org/10.1016/j.jddst.2021.102356.
［24］ QIU Y, MAN R C H, LIAO Q, et al.. Effective mRNA pulmo?nary delivery by dry powder formulation of PEGylated synthet?ic KL4 peptide[J]. J. Control. Release Off. J. Control. ReleaseSoc., 2019, 314: 102-115.
［25］ MUTUKURI T T, DARWISH A, STRONGRICH A D, et al..Radio frequency-assisted ultrasonic spray freeze drying for phar?maceutical protein solids[J]. J. Pharm. Sci., 2023, 112(1): 40-50.
［26］ PAN H W, SEOW H C, LO J C K, et al.. Spray-dried andspray-freeze-dried powder formulations of an anti-interleukin4Rα antibody for pulmonary delivery[J]. Pharm. Res., 2022,39(9): 2291-2304.
［27］ YU S H, PU X H, AHMED M U, et al.. Spray-freeze-dried inhal?able composite microparticles containing nanoparticles of combi?national drugs for potential treatment of lung infections caused byPseudomonas aeruginosa[J/OL]. Int. J. Pharmaceut., 2021, 610: 9[2021-10-01]. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm. 2021.121160.
［28］ DORETH M, HUSSEIN M A, PRIEMEL P A, et al.. Amor?phization within the tablet: using microwave irradiation to forma glass solution in situ[J]. Int. J. Pharm., 2017, 519(1-2):343-351.
［29］ GITTER J H, GEIDOBLER R, PRESSER I, et al.. Microwaveassisted freeze-drying of monoclonal antibodies: product qualityaspects and storage stability[J/OL]. Pharmaceutics, 2019, 11(12):674[2019-12-18]. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics11120674.
［30］ HARDTER N, GEIDOBLER R, PRESSER I, et al.. Accelerat?ed production of biopharmaceuticals via microwave-assistedfreeze-drying (MFD)[J/OL]. Pharmaceutics, 2023, 15: 15[2023-04-27]. https:// doi.org/10.3390/pharmaceutics15051342.
［31］ YU Y S, ABOULFOTOUH K, XU H, et al.. Feasibility of intra?nasal delivery of thin-film freeze-dried, mucoadhesive vaccinepowders[J/OL]. Int. J. Pharm., 2023, 640: 122990[2023-12-20]. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2023.122990.
［32］ HUFNAGEL S, XU H, SAHAKIJPIJARN S, et al.. Dry pow?ders for inhalation containing monoclonal antibodies made bythin-film freeze-drying[J/OL]. Int. J. Pharm., 2022, 618: 121637[2022-03-09]. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2022.121637.
［33］ ABOUL FOTOUH K, UNO N, XU H, et al.. Formulation of drypowders of vaccines containing MF59 or AddaVax by thin-filmfreeze-drying: towards a dry powder universal flu vaccine[J/OL].Int. J. Pharm., 2022, 624: 122021[2022-07-17]. https://doi. org/10.1016/j.ijpharm.2022.122021.
［34］ YAN J K, WU L X, QIAO Z R, et al.. Effect of different dryingmethods on the product quality and bioactive polysaccharidesof bitter gourd (Momordica charantia L.) slices[J]. Food Chem.,2019, 271: 588-596.
［35］ MEHANNA M M, ABLA K K. Recent advances in freeze-drying:variables, cycle optimization, and innovative techniques[J].Pharm. Dev. Technol., 2022, 27(8): 904-923.
［36］ GUO Y, BALDELLI A, SINGH A, et al.. Production of highloading insulin nanoparticles suitable for oral delivery by spraydrying and freeze drying techniques[J/OL]. Sci. Rep., 2022, 12:9949[2022-06-15]. https://doi.org/10.1038/s41598-022-13092-6.
［37］ FADEEL M R A, EL-DAKHLY A T, ALLAM A M, et al..Preparation and efficacy of freeze-dried inactivated vaccineagainst bovine viral diarrhea virus genotypes 1 and 2, bovineherpes virus type 1.1, bovine parainfluenza-3 virus, and bo?vine respiratory syncytial virus[J]. Clin. Exp. Vaccine Res.,2020, 9(2): 119-125.
［38］ 姚舜禹,張麗琳 . 新城疫疫苗研究進展[J]. 生物技術進展,2020,10(5):470-478.YAO S Y, ZHANG L L. Progress on Newcastle disease vac?cine[J]. Curr. Biotechnol., 2020, 10(5): 470-478.
［39］ TYRRELL D A, RIDGWELL B. Freeze-drying of certain virus?es[J]. Nature, 1965, 206: 115-116.
［40］ ABAYNEH T, GETACHEW B, GELAYE E, et al.. Viabilityevaluation of freeze dried and suspension anthrax spore vac?cine formulations stored at different temperatures[J]. Vaccine,2021, 39(42): 6245-6249.
［41］ SHOKRI S, SHAHKARAMI M K, SHAFYI A, et al.. Evalua?tion of the thermal stability of live-attenuated Rubella vaccine(Takahashi strain) formulated and lyophilized in different stabi?lizers[J]. J. Virol. Meth., 2019, 264: 18-22.
［42］ JAMIL R K, TAQAVIAN M, SADIGH Z A, et al.. Evaluationof the thermal stability of a novel strain of live-attenuated mumps vaccine (RS-12 strain) lyophilized in different stabiliz?ers[J]. J. Virol. Meth., 2014, 199: 35-38.
［43］ MATSUMOTO K, OHFUJI S, INOHARA K, et al.. Effective?ness of live attenuated varicella-zoster vaccine in adults olderthan 50 years in Japan: a retrospective cohort study[J/OL].Vaccines, 2023, 11: 9[2023-01-25]. https://doi.org/10.3390/vaccines11020259.
［44］ CLÉNET D, HOURQUET V, WOINET B, et al.. A sprayfreeze dried micropellet based formulation proof-of-concept fora yellow fever vaccine candidate[J]. Eur. J. Pharm. Biopharm.2019, 142: 334-343.
［45］ KELLY S H, OPOLOT E E, WU Y Y, et al.. Tabletized supramo?lecular assemblies for sublingual peptide immunization[J/OL].Adv. Healthc. Mater., 2021, 10: 6[2021-02-01]. https://doi.org/10.1002/adhm.202001614.
［46］ WUI S R, KIM K S, RYU J I, et al.. Efficient induction of cellmediated immunity to varicella-zoster virus glycoprotein E colyophilized with a cationic liposome-based adjuvant in mice[J].Vaccine, 2019, 37(15): 2131-2141.
［47］ ARNEMO M, VIKSMOEN WATLE S S, SCHOULTZ K M,et al.. Stability of a vesicular stomatitis virus-vectored Ebolavaccine[J]. J. Infect. Dis., 2016, 213(6): 930-933.
［48］ PRESTON K B, MONTICELLO C R, WONG T A S, et al..Preservation of quaternary structure in thermostable, lyophi?lized filovirus glycoprotein vaccines: a search for stability-indi?cating assays[J]. J. Pharm. Sci., 2020, 109(12): 3716-3727.
［49］ PACKER M, GYAWALI D, YERABOLU R, et al.. A novelmechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticledelivery systems[J/OL]. Nat. Commun., 2021, 12: 6777 [2021-11-24]. https:// doi.org/10.1038/s41467-021-26926-0.
［50］ AI L, LI Y, ZHOU L, et al.. Lyophilized mRNA-lipid nanopar?ticle vaccines with long-term stability and high antigenicityagainst SARS-CoV-2[J/OL]. Cell Discov., 2023, 9: 9[2023-01-23]. https:// doi.org/10.1038/s41421-022-00517-9.
［51］ LI Z Y, ZHANG X Q, HO W, et al.. Lipid-polymer hybrid “par?ticle-in-particle” nanostructure gene delivery platform exploredfor lyophilizable DNA and mRNA COVID-19 vaccines[J/OL].Adv. Funct. Mater., 2022, 32: 16 [2022-07-22]. https://doi.org/10.1002/adfm.202204462.
［52］ 李巖異,呂娜,賈思凝,等 .體外組裝的病毒樣顆粒在疫苗和藥物遞送中的應用[J].生物技術進展,2023,13(2):201-209.LI Y Y, LYU N, JIA S N, et al.. Application of virus like parti?cles assembled in vitro in vaccine and drug delivery[J]. Curr.Biotechnol., 2023, 13(2): 201-209.
［53］ YADAV R, ZHAI L, KUNDA N K, et al.. Mixed bacteriophageMS2-L2 VLPs elicit long-lasting protective antibodies againstHPV pseudovirus 51[J/OL]. Viruses, 2021, 13(6): 1113[2021-07-03]. https://doi.org/10.3390/v13061113.
［54］ XU H, BHOWMIK T, GONG K, et al.. Thin-film freeze-dryingof a bivalent Norovirus vaccine while maintaining the potencyof both antigens[J/OL]. Int. J. Pharm., 2021, 609: 121126[2023-12-20]. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2021.121126.
［55］ MENSCH C, CHINTALA R, NAWROCKI D, et al.. Enablinglyophilized pneumococcal conjugate vaccines through formula?tion design and excipient selection suitable for A multivalentadjuvanted vaccine[J]. J. Pharm. Sci., 2021, 110(1): 97-107.
本文作者劉容麟、王寧、李巖異、 張衛婷、羅楚、牛維兵，華北制藥金坦生物技術股份有限公司、石家莊市農業技術推廣中心，來源于生物技術進展，僅供交流學習。
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