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嘉峪檢測網 2024-11-18 19:39
改進病毒規(guī)模化生產效率，優(yōu)化疫苗生產工藝是病毒疫苗研制的關鍵環(huán)節(jié)。目前，國內動物細胞制備病毒疫苗的操作方式逐漸從轉瓶培養(yǎng)向生物反應器培養(yǎng)轉變。生物反應器培養(yǎng)動物細胞的常見方法有懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、片狀載體培養(yǎng)等。生物反應器培養(yǎng)動物細胞有很多優(yōu)勢，可擴大病毒產量，降低成本，易于獲取穩(wěn)定性強、免疫原性高的病毒，有助于機械化控制。生物反應器有潮汐式生物反應器、一次性搖動式生物反應器、一次性填充床生物反應器、微小型生物反應器、新型固定床生物反應器，不同的反應器有不同的特點。對生物反應器培養(yǎng)動物細胞技術在病毒疫苗生產應用領域的研究進行綜述，為促進生物反應器的開發(fā)與研究提供參考。
疫苗接種是預防流行性疾病的有力武器。目前，國內動物細胞制備病毒疫苗的操作方式逐漸從轉瓶培養(yǎng)向生物反應器培養(yǎng)轉變，后者因其成本低廉、生產效率高、生產規(guī)模大而備受關注［1］。但我國生物反應器動物細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展水平與先進國家相比，仍存在較大差距［2］。應用創(chuàng)新型生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞無疑成為加快疫苗類產品研發(fā)的關鍵，在整個疫苗生產鏈中將起到重要作用。
1、生物反應器培養(yǎng)動物細胞的常見方法
參照細胞在貼壁與懸浮培養(yǎng)上的差異特性，應用生物反應器動物細胞培養(yǎng)技術多涵蓋懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、片狀載體培養(yǎng)等方法［2］。
1.1懸浮培養(yǎng)
懸浮培養(yǎng)條件單一且具備良好的傳質、傳氧效果，借助裝置振動使細胞處于分散狀態(tài)，多用于單細胞及微小細胞團的系統(tǒng)培養(yǎng)。劉萍等［3］利用此技術生產細胞源禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV) 滅活疫苗，選取一株來源清晰的貼壁犬腎細胞(MDCK) 以貼壁與懸浮兩種方式進行培養(yǎng)，并采用免疫血清學法，針對細胞源、雞胚源不同來源的病毒制備滅活疫苗并進行評價，結果表明，MDCK 細胞懸浮液培養(yǎng) 48h，細胞密度約為每毫升 3.0×106個，與貼壁細胞培養(yǎng)相比，細胞形態(tài)結構清晰，具有較高的細胞活力，且疫苗免疫效果與雞胚疫苗相近，易實現(xiàn)穩(wěn)定增殖。王笑天等［4］以貼壁與無血清懸浮兩種培養(yǎng)方式比較被乙型流感病毒感染的 MDCK細胞的增殖情況，在無血清懸浮培養(yǎng)下，流感病毒于MDCK 細胞增殖產生的 HA 血凝滴度更高，為采用生物反應器大規(guī)模生產流感疫苗奠定了基礎。懸浮培養(yǎng)技術在豬圓環(huán)疫苗生產中的應用表明，細胞懸浮培養(yǎng)相比于貼壁培養(yǎng)技術在疫苗生產中具備更明顯的應用優(yōu)勢與更強的免疫原性［5］。現(xiàn)階段，以生物反應器為基礎的細胞懸浮培養(yǎng)技術平臺正逐步建立與完善，合理的設計思路與突破的革新方法，可促使該平臺在推動疫苗規(guī)模化生產上發(fā)揮積極作用。
1.2微載體培養(yǎng)
微載體主要通過為細胞提供貼附接觸面積的方式實現(xiàn)細胞的生長繁殖。微載體因體積小、比重輕等獨特優(yōu)點，在無外界或輕度外力的攪拌和影響下，能完全自由均勻地分布在整個固體培養(yǎng)基內。該材料生物相容性高、制備簡單、可反復多次使用，降低了動物細胞培養(yǎng)的生產成本。華濤等［6］采用生物反應器微載體懸浮培養(yǎng) PK15 細胞，以感染復數(shù)為 0.1 的接毒比例微載體培養(yǎng)三代后，所得病毒液效價可達 107.25 TCID50/mL，為工業(yè)化的規(guī)模生產提供了有效的數(shù)據(jù)支撐。王昊等［7］利用微載體懸浮培養(yǎng)接種豬細小病毒 L 的豬睪丸傳代細胞系( ST 細胞) ，經二乙烯亞胺( BEI) 溶液滅活、濃縮等步驟制備滅活疫苗，接毒 72 h 后收獲病毒，滴度為8.14 logTCID50/mL，經滅活后制備疫苗并免疫豚鼠，可獲得較高抗體效價。葉陽等［8］分別在 5 L、50 L 的生物反應器內微載體懸浮培養(yǎng) Marc145 細胞，確定適宜的微載體濃度為 2.5 g /L 與 3.0 g /L，該條件下能保證細胞和病毒增殖所需營養(yǎng)且符合經濟要求，提高抗原效價的優(yōu)勢最為顯著。與傳統(tǒng)的轉瓶式培養(yǎng)方法相比，微載體技術能夠通過大幅提升細胞表面黏附膜的覆蓋面積，降低細胞所需的培養(yǎng)容器數(shù)量，減少資源和空間成本的消耗，獲得較高的病毒滴度與抗體效價。
1.3片狀載體培養(yǎng)
片狀載體培養(yǎng)是通過一定材質的填充材料，借助片狀載體袋的前后與左右擺動完成培養(yǎng)階段的傳質、傳氧，在靜態(tài)、動態(tài)的結合方式下，提升傳質、傳氧效率，以供細胞貼壁繁殖［9］。張家友等［10］在 7.5 L 生物反應器中對片狀載體培養(yǎng)參數(shù)展開優(yōu)化，在初始細胞接種密度為每毫升 2×105個，攪拌轉速為 120 r/min 的片狀載體下，最高細胞密度為( 10. 22 ± 0. 69) × 106個/mL。此方法可獲得更高的細胞密度，但存在細胞密度不易放大的缺陷。楊屹等［11］ 利用 14 L 生物反應器培養(yǎng)Vero 細胞用于人用狂犬病疫苗的生產，向其中的 10 L培養(yǎng)液接種 5.0×109個 Vero 細胞，以灌流培養(yǎng)方式維持培養(yǎng)液中 1.0 g /L 的葡萄糖含量，經 156 h 的培養(yǎng)，所得細胞密度可達 1.0×107個/mL。許冬等［12］將豬圓環(huán)病毒 2 型( PCV2) 接種至 PK-15 細胞懸液中轉瓶培養(yǎng)，完成 2 次帶毒傳代后轉接種至片狀懸浮，連續(xù)收獲5 次以上后，有效抗原含量相比于傳統(tǒng)工藝可大幅提高 5～10 倍，確定最佳的片狀載體細胞接種濃度為每毫升 0.5×106個細胞。片狀載體較于微載體的培養(yǎng)工藝，能提高細胞與設備的分離效率，并在實際生產過程中極大降低生產成本。此外，在穩(wěn)定性方面，片狀載體對于外界攪拌系統(tǒng)剪切力的抗干擾性更強，保證細胞培養(yǎng)液間充分交換，獲得更高的病毒滴度，利于后續(xù)疫苗的純化操作。
2、生物反應器培養(yǎng)動物細胞的優(yōu)勢
2.1擴大病毒產量
生物反應器的推廣能改變動物細胞的培養(yǎng)方式，在增加動物細胞密度的基礎上，有效提高病毒滴度，利于擴大病毒產量。PAＲK 等［13］在 200 L 生物反應器中懸浮培養(yǎng) BHK-21 細胞，第 3 天即得到每毫升 7.65×106個細胞的活細胞密度。該細胞為口蹄疫病毒疫苗制造的連續(xù)細胞系，充分提升了口蹄疫疫苗的生產潛力。
2.2降低成本
生物反應器的推廣推動了口服疫苗的進程，有利于在確定的培養(yǎng)條件下快速、重復性地展開生產，發(fā)揮更高的成本效益。LESELLIEＲ 等［14］為降低英國牛結核病發(fā)病率，選擇對攜帶傳染源牛分枝桿菌的歐洲獾進行結核病的疫苗接種。在廣闊的地理范圍內，采用口服方式能充分發(fā)揮疫苗的最佳療效。但口服減毒卡介苗的常規(guī)生產多基于液體培養(yǎng)基表面的薄膜生長，利用生物反應器開展培養(yǎng)，所得濃度能遠遠超過同條件下的薄膜生長，在簡化制作工序的同時，更加強了操作的循環(huán)性，實現(xiàn)成本節(jié)約。
2.3易于獲取穩(wěn)定性強、免疫原性高的病毒
生物反應器內的培養(yǎng)環(huán)境較為單一，易于獲取穩(wěn)定性強、免疫原性高的病毒。LIU 等［15］針對導致手足口病的腸道病毒 A71 的疫苗生產進行探究，在半分批工藝及灌注技術下，可將產量提高 7 ～ 14 倍，獲得的候選疫苗同單批獲得的候選疫苗相比，具備相似效力及較強穩(wěn)定性，拓寬了可行的技術工藝。
2.4有助于機械化控制
生物反應器的推廣有助于機械化控制，利用培養(yǎng)狀態(tài)的實時監(jiān)測，促進整個反應生產過程的透明化。基于生物反應器搭建的控制系統(tǒng)能實現(xiàn)生物反應過程中的參數(shù)檢測、控制和監(jiān)控，例如搭建針對實驗室厭氧發(fā)酵實驗中所產氣體的在線監(jiān)測系統(tǒng)，有效解決了厭氧發(fā)酵周期長、人工測量勞動強度大的問題，拓展了設備的實時性和靈敏度。
3、創(chuàng)新型生物反應器的應用
隨著生物反應器使用范圍的擴大，其結構與組成也在不斷變化。作為現(xiàn)代生物工程在大規(guī)模食品生產過程中重要的核心應用裝置，其設計結構上的科學合理性將直接決定生物反應器的運行效率［14－15］。
3.1一次性生物反應器
3.1.1 潮汐式生物反應器
潮汐式生物反應器是一種能夠用于高密度細胞培養(yǎng)操作的臺式生物反應器，其中包括 CelCradleTM生物反應器，在蛋白質制造、病毒和單克隆抗體的高密度細胞培養(yǎng)方面均發(fā)揮了突出作用［16－17］。作為世界上唯一能夠一次性大規(guī)模使用的具有細胞數(shù)據(jù)自動采集功能的生物反應器，其應用范圍也涵蓋廣泛。通過培養(yǎng)基的左右擺動，使得細胞在各種外界動態(tài)環(huán)境條件下，能快速高效地吸收來自培養(yǎng)基中的各種養(yǎng)分和氧氣［18］。尹娜等［16］完成了應用于潮汐式生物反應器的 CelCradleTM的輪狀病毒接種試驗，通過在生物反應器培養(yǎng)基中連續(xù)注射 3×108個非洲綠猴腎細胞(Vero 細胞) ，連續(xù)培養(yǎng) 7 d，活細胞數(shù)量高達 2.75×109個，接種輪狀病毒 ZTＲ-68 株 96h，病毒滴度也同時達到了最佳水平。
3.1.2 一次性搖動式生物反應器
一次性搖動式生物反應器是一款小容量的生物反應器，可用于在一次性培養(yǎng)袋中培養(yǎng)哺乳動物細胞和植物細胞。它具有設置方式快速簡單、易實現(xiàn)無障礙放大等特點。JULIANA 等［19］評估了一款耦合切向流過濾和交替切向流過濾的搖動式生物反應器，證明其在灌注運行模式下的最大病毒滴度為 3.28 ～ 3.73 log10 (HA 單位/mL)。該反應器在灌注運行模式下，能充分簡化從搖瓶到大型生物反應器的運行過程，有利于幫助人類對重大流行性疾病做出快速反應。
3.1.3 一次性填充床生物反應器
SUN 等［20］采用一次性填充床生物反應器對 MDCK 進行細胞培養(yǎng)和流感病毒 H1N1 感染，保證接種細胞在 37℃與 5%的 CO2條件下生長增殖，攪拌速度保持在 45 r/min。借助有效監(jiān)測數(shù)據(jù)得知，在該適宜條件下培養(yǎng) 6 d，細胞總數(shù)可由 2.0×109個增至 3.2×1010個。完成 3 d 細胞感染后的最大病毒滴度為 768( HA 單位/μL) 。
3.2微小型生物反應器
微小型生物反應器是一款體積微小，具備良好分析檢測及控制功能的反應系統(tǒng)。因其體積微小，能耗較少而被廣泛推廣應用。在實現(xiàn)高通量生物技術開發(fā)過程中，它可以精確保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，減少整體細胞培養(yǎng)周期，從而加快疫苗產品的研發(fā)進程。它的出現(xiàn)更為“精準醫(yī)學”這一概念的傳播奠定了發(fā)展基礎。李雪良等［21］詳細闡述了當前微小型生物反應器的應用現(xiàn)狀。采用微小型生物反應器能夠從源頭上實現(xiàn)精確測量和環(huán)境參數(shù)控制，提高研發(fā)效率，保證細胞生長的微環(huán)境，從而發(fā)揮其在生物醫(yī)藥領域的突出優(yōu)勢。
3.3新型固定床生物反應器
為有效地克服我國現(xiàn)有固定床生物反應器裝置結構煩瑣，操作工藝復雜，操作過程易產生氣泡干擾生產效率等一系列共性問題，研制一款結構簡易式的新型固定床生物反應器成為行之有效的技術應對策略。聶簡琪等［22］應用新型固定床生物反應器，在接毒 5 d后，收獲病毒總顆粒數(shù)為 10. 37 log10 TCID50，等價于2.3×105劑量疫苗的生產量，為細胞源疫苗的大量擴產提供了合理的技術支持。BERRIE 等［23］利用新型固定床生物反應器有效解決了貼壁細胞培養(yǎng)占地面積大、生產受限條件多、人工成本高的缺陷。該反應器能產生病毒滴度大小為 5×1010 pfu /cm2，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式僅為 2.67×106 pfu /cm2，為病毒疫苗的生產提供了有效的擴大工藝。聶簡琪［24］基于片狀載體、新型支架與TubeSpin 建立了固定床生物反應器縮小模型，此模型相比于微載體培養(yǎng)，能獲得更高密度的動物細胞，在低密度接種及無血清培養(yǎng)方面也有一定優(yōu)勢。
4、展 望
應用生物反應器動物細胞培養(yǎng)技術展開工廠化的病毒疫苗生產，在國外已日趨成熟，我國疫苗研發(fā)市場發(fā)展迅速，盡管與發(fā)達國家相比仍存在一定程度的差距，但成效顯著，生物醫(yī)藥產業(yè)水平穩(wěn)步提升［25］。伴隨著生物反應器設備的優(yōu)化，越來越多規(guī)模化的動物細胞培養(yǎng)技術開始了更加具備創(chuàng)新涵義與價值取向的變革，為基于細胞培養(yǎng)的病毒疫苗產業(yè)化生產提供了新選擇，這必將推動我國醫(yī)用疫苗領域的長足突破。
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本文作者高歌，天津科技大學生物工程學院，來源于中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，僅供交流學習。
來源：Internet
