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前言

細胞庫檢定和病毒清除驗證由于涉及到病毒檢項，企業一般會選擇第三方服務商來處理。但是由于中國和歐美在這個項目上的法規不同，導致需要同時考慮海外市場的企業要花額外的精力去設計一個滿足雙報需求的方案。2020年1月21日，國家藥品監督管理局（簡稱：NMPA）發布“國家藥監局關于適用《Q2（R1）：分析方法論證：正文和方法學》等11個國際人用藥品注冊技術協調會指導原則的公告（2020年第7號）”。公告明確：本公告發布之日起6個月后（即：2020年7月10日）開始的藥學研究（以試驗記錄時間點為準），適用ICH指導原則, 其中包含了ICH Q5A (R1)和Q5B。這表明了國內法規和歐美法規有趨同的趨勢，也對雙報項目病毒安全性的管理產生了影響。此外2020年新版藥典即將發布，在此，也根據征求意見稿的情況加以討論。

簡介

使用細胞（人源或動物源）生產的生物技術產品的一個共同特點是存在病毒污染的危險性，這種病毒污染在臨床上可產生嚴重的后果。病毒污染可來自細胞系(細胞基質)本身，也可來自生產過程中偶然帶入的外源病毒。病毒安全性始終是產品質量研究的一項重要環節，一般通過細胞庫檢定、原輔料測試以及純化工藝的病毒清除驗證來保證工藝過程中的生物安全性。但是，由于國內外申報所依據的法規不同，具體要求也會有所差異。

其中，ICH Q5A（R1）：《來源于人或動物細胞系的生物技術產品的病毒安全性評價》是關于國外生物技術產品申報材料病毒安全性評價的主要參照法規。另外，對于FDA申報，美國藥典、Pointsto Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products forHuman Use、Pointsto Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals以及9 CFR等也是需要參照的法規；同樣，對于EMA來說，需要參照歐洲藥典、Guidelineon Virus Safety Evaluation of Biotechnological IMP等一系列相關法規。而中國國內申報主要依據《中國藥典》第三部（2015版）“生物制品生產檢定用動物細胞基質制備及檢定規程”和《生物組織提取制品和真核細胞表達制品的病毒安全性評價技術審評一般原則》。這種評價依據差異情況使得中外雙報的項目需要充分考慮中國和海外申報區域法規的不同，而不能簡單地將一套數據應用在另一個地方。

本文將從（1）對細胞系和其他原材料進行選擇和測試，確保其不含可能對人有感染和/或致病作用的病毒。（2）對生產工藝中清除病毒的能力進行評估。等兩個方面，對中外申報材料中病毒安全性評價的差異和趨勢進行論述。

細胞系和其他原材料的病毒檢測

在生產生物制品時，需要建立多級細胞庫，包括原始細胞庫（PCB），主細胞庫（MCB），工作細胞庫（WCB）以及生產終末細胞庫（EOPC）等。不同的細胞庫所具有的功能不同，ICH以及各國的法規對其病毒檢定的要求也是不同的。

（1）其中ICHQ5A(R1)規定不同級別細胞進行的病毒測試方法（表一）：

a 達到限傳代次的細胞:在體外達到傳代限度的生產細胞

b 也可測定其他因子。

c 若逆轉錄病毒感染試驗為陽性，則無須作。

d 指適用于已受此因子感染的細胞系。

e 第一個WCB時，此測試應在該WCB產生的達到體外限傳代次細胞上進行；以后的WCB，可直接在WCB上進行單項體外和體內測試，或在達到體外限傳代次的細胞上測試。

f 例如MAP、RAP、HAP--通常適用于嚙齒細胞系。

g 例如，適用于人、非人靈長目或其他細胞的測試方法。

（2）中國藥典第三部（2015版）（表二）：

注：①表示生產終末細胞，是指在或超過生產末期時收獲的細胞，盡可能取按生產規模制備的生產末期細胞。“+ ”為必檢項目，“-”為非強制檢定項目。（+）表示需要根據細胞特性、傳代歷史、培養過程等情況要求的檢定項目。

由以上可知，對于各級細胞庫，我們應該全面的梳理細胞的特性、培養歷史以及操作過程，然后對病毒安全性做出合理的評估和檢測。根據ICH Q5A的要求，應對MCB進行內源性和非內源性病毒污染的檢測；如果不檢測MCB，也可以使用WCB全面檢測進行替代。另外，還要求對達到體外細胞傳代限次細胞進行病毒檢測。根據中國藥典第三部（2015版）MCB需要進行全面的檢測，并且要求對EOPC進行檢定，而ICH法規規定在申報IND之前對EOPC檢定沒有要求。如果要進行中外雙申報，建議依據中國法規進行EOPC的檢定，并且對EOPC進行與MCB檢定要求一致的檢定。

如果在細胞系構建、細胞建庫過程或者生產過程中使用了動物源成分，則需要開展有針對性的病毒檢測，如牛源性病毒和豬源性病毒檢測。對于牛源性病毒（牛血清等）來說，美國要求參照9CFR，涉及的病毒檢測包括BVDV,BAV5, BPV, BTV, BRSV, REO3, RV, IBR, PI3等病毒，而中國藥典要求檢測的病毒為BPI3, PI3, BAV-3, BPV, BVDV, REO3, RV等病毒。同樣，對于豬源性病毒（胰蛋白酶等），美國要求參照9CFR，需檢病毒為PPV,TGEV, PAV, REO3, HEV, BVDV, PI3, RV等病毒，而中國藥典沒有具體規定，需要根據具體情況來進行評估和檢測。

另外，ICH規定：對于嚙齒類動物細胞系中的物種特異性病毒的檢測，可將被測試樣品接種到無病毒的動物中去，經一段特定時間后測定其血清抗體水平或酶活性。這種試驗包括：小鼠抗體產生試驗(MAP)、大鼠抗體產生試驗(RAP)和倉鼠抗體產生試驗(HAP)。而中國藥典第三部（2015版）也提及相關的試驗，但是沒有提及具體檢測的病毒。在中國藥典（2020版）增加了“鼠源性病毒檢查法”，要求檢定8中鼠源性病毒，分別為淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒、出血熱病毒、脫腳病病毒、仙臺病毒、小鼠肺炎病毒、III 型呼腸孤病毒、小鼠腺病毒、小鼠白血病病毒，這也可以作為我們進行抗體產生試驗的一個參考。事實上不同的動物對不同的病毒靈敏度及反應性不同，這是為什么法規會推薦多種動物進行抗體實驗的原因。

ICH Q5A(R1)規定具體參加下表（表三）：

注：1、有證據表明能感染人和靈長目動物的病毒；2、無證據表明能感染人的病毒；3、能在體外細胞中進行復制的來源于人或靈長目動物的病毒 

對生產工藝中清除病毒的能力進行評估

（1）未經處理的原液（UPB）病毒檢測

UPB包括集中回收的一批或多批細胞和培養基，如果存在病毒或病毒樣顆粒，其濃度是最為富集的，容易檢出。根據 ICH Q5A 的建議，生物制品在進行上市注冊申請時，至少應上報 3 批中試生產或規模化生產的未經處理原液的病毒安全性研究資料。《生物組織提取制品和真核細胞表達制品的病毒安全性評價技術審評一般原則》要求在申報IND之前就應該進行3批中試生產或規模化生產的未經處理原液的病毒安全性研究。

在UPB病毒安全性評價時，一般使用多種細胞系進行體外篩查試驗；如適用，可使用聚合酶鏈式反應(PCR) 或其他適當的方法。另外，ICHQ5A(R1)也要求對UPB需進行電子顯微鏡檢測以檢測逆轉錄病毒的存在。

（2）生產工藝病毒去除/滅活的驗證與研究

在生物制品的生產工藝步驟中要求設計病毒去除/滅活步驟，以對潛在的病毒污染風險進行控制。并且，在開展人體臨床試驗前，進行初步的驗證與研究，說明設置步驟的合理性和有效性。2019年6月27日，國家藥典委員會發布了《生物制品病毒安全性控制公示稿》，這個藥品標準草案的公示無疑把生物制品的病毒清除/滅活的標準化提上日程。

進行國外申報或者中外雙報，由于指導原則的不同必然造成國內外申報存在一些差異（表四）。在IND申報時，中外在指示病毒選擇、工藝選擇以及重復性上差異較大；而在BLA申報時，中國國內在指示病毒選擇和工藝選擇上會參照國外的指導原則和法規（ICH Q5A等），而重復性上要求三批次。

表四：國內外申報病毒清除驗證的差異比較

①指示病毒的差異

病毒清除研究中的一個主要問題是確定使用何種病毒。這些病毒可分為三類:“相關”病毒、特異“模型”病毒和非特異“模型”病毒。“相關”病毒是指用于生產過程中評價病毒清除情況的病毒，可以是已被鑒定的病毒，或是與已知病毒種類相同的病毒，或是可能會污染細胞培養物或污染生產過程中使用的其他試劑或材料的病毒。如果得不到“相關”病毒，或它不太適用于清除病毒的工藝評價研究(如不能離體培養到足夠的滴度)，應使用特異“模型”病毒代替。

國外法規雖沒有做出具體的要求，但是要求盡可能選擇污染產品最相似的病毒進行驗證，即特異性指示病毒；同時也需要關注具有廣泛理化性質的非特異性病毒。

而中國的病毒安全性評價指導原則要求比較詳細具體，明確指出了清除驗證中所應使用病毒的類型。法規要求：“一個典型的驗證研究所選擇的病毒，至少應包括單鏈和雙鏈的RNA及DNA、脂包膜和非脂包膜、強和弱抵抗力、大和小顆粒等病毒；去除/滅活技術方面可根據采用的具體方法選擇恰當的適宜病毒。”

當然，關于如何指示病毒的核心需要以在整個生產過程中可能出現的污染病毒為主，并且結合能夠用于評價驗證效果的指示病毒的可獲得性與相關培養試驗條件進行合理設計。

②工藝選擇差異，效果要求略有不同

根據表四可知，中國國內IND申報時，一般選擇低pH（或者有機溶劑/去污劑(S/D)）和膜過濾這兩個工藝。國外進行IND申報時，除了選擇以上這兩個工藝外，還需加一個層析工藝（如果還是達不到要求，還需再加一步層析）。

生物制品工藝驗證與研究中，需要針對以上對病毒具有去除或滅活效果的純化步驟進行充分的驗證，根據研究的結果評價整體工藝對病毒安全性的防控效果。

③重復性差異

中國國內的指導原則雖然沒有硬性的規定，但通常需要做三個批次（GMP或non-GMP都可以）。在ICH法規中，明確指出至少分別做兩次獨立的研究來證實清除的可重復性，因此一般是一批樣品（一般要求GMP）重復兩次。

總結與討論

病毒安全性評價是生物制品生產中的一項重要的研究項目。病毒安全性評價包括病毒檢測和病毒滅活/去除兩大塊項目，其中病毒檢測包括細胞庫（PCB/MCB/WCB/EOPC）病毒檢定和UPB病毒檢測。關于病毒安全性評估，每個國家都有自己相關的法規和指導原則。由于這種原因使得我們國內的很多生物制藥企業對于國外申報或者中外申報“望而卻步”。

由于病毒安全性評價各國所參照的法規不一致，其關于細胞庫檢定中病毒檢測方面，可以看出中外申報雖然各方面檢測要求比較一致，但是還是有差異的。例如，在牛源性病毒和豬源性病毒方面，所參照的法規不一致，所要檢測的病毒也不一致；在抗體產生試驗檢測部分，所要檢測的病毒也是不一致的；在細胞庫檢定類型方面，國外IND申報不要求對EOPC進行檢定。在病毒清除研究方面中外申報的要求也是存在許多不同的，包括指示病毒選擇、工藝步驟選擇以及重復性方面。

隨著中國加入并成為ICH管理委員會成員，NMPA的法規逐漸與ICH接軌，技術指導原則等也越來越向其靠攏。2020年1月21日NMPA發出公告，自2020年7月10日開始的國內申報材料中藥學研究部分關于病毒安全性評價及方法驗證，適用于ICH Q5A(R1)和ICHQ5B指導原則。這也就是說，在2020年7月10日之后，我們如果需要進行中外申報可以按照國際申報的要求，尋求遵循GMP的合格第三方檢測機構來進行相關的研究。按照國外申報要求進行細胞庫病毒檢測，在國內申報也是可行的；并且在以后的病毒清除研究中，我們也許可以真正的只采用一批GMP批次并按照國際申報的要求進行研究，就可以滿足中外雙報的要求。這無疑是給我們國內的生物制藥企業打了一針“強心劑”，使越來越多制藥企業選擇中美雙報或多國多報，從而加速藥品上市。

后記

病毒安全性評價是生物制品生產過程中極其重要的一項，在生物制品細胞庫建立和生產工藝里應該重點考慮和設計的步驟。但是由于各國相關的指導原則和法規的不同，導致了國內許多中外雙報的生物制藥企業在病毒安全性評價方面尋找不到合格的服務供應商。中國NMPA公告開始適用于ICH法規（ICH Q5A和ICH Q5B），這也明示這按照國外申報的要求進行研究也是符合中國國內的申報要求。