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嘉峪檢測網 2024-11-04 08:41
疫苗類產品的安全性評價是個很大的話題，盡量在一篇文章中能提綱挈領的說清要點。當然，首先要遵循的還是各類指南，NMPA（原SFDA）、FDA、EMA、ICH和WHO出臺了很多指導性文件，清單羅列如下。
與傳統生物藥相比，針對感染性疾病的疫苗最大的不同在于供試品為外源性蛋白或糖類，與人體或動物源成分幾乎沒有任何同源性。非感染性疾病則相反，如腫瘤疫苗，針對的主要是內源性蛋白或新生抗原，非感染性疫苗的非臨床安全性評價不在本次討論之列。
疫苗主要的毒理學研究終點與小分子化藥和傳統生物藥相似，但也有其特別之處，比如需要考察動物是否產生了預期的特異性免疫反應。除了標準毒理研究，根據疫苗類型和適應癥，需要開展額外毒理研究，比如神經毒性和生物分布。此外，對于種屬選擇、給藥方式、非抗原疫苗組分、佐劑、給藥裝置、注射位點等因素也要予以關注。下文將圍繞用于感染性疾病的疫苗非臨床評價關注點進行展開。
疫苗的形式
目前應用于非感染性疾病的疫苗多是將整個病原體滅活或減毒的類型。這類疫苗的免疫反應通常比較強，但是也有其缺點，比如產生對非相關抗原的免疫反應、失活疫苗的逆轉風險、抗原組分過于復雜等。此外，全病毒或細菌疫苗對于產品的純度、工藝放大、批間質量一致性也有挑戰。因此，疫苗企業開發了亞單位或個體化疫苗。亞單位疫苗僅包括產生預期免疫反應的抗原，包括蛋白、多糖、多糖偶聯物、類毒素等，比如乙肝病毒疫苗、白喉疫苗、破傷風疫苗、肺炎球菌疫苗等。除了以上，近幾年出現了一些新型疫苗形式如核酸疫苗，包括DNA質粒、mRNA或重組病毒載體。其中DNA質粒和重組病毒載體的穩定性較好，mRNA則會被體內的酶降解，需要用脂質納米粒包裹保護后進行遞送。COVID-19的流行為核酸疫苗的快速發展起到了重要推動作用。
抗原
對于滅活的疫苗，抗原通常由病原體表面的各種蛋白質組成。亞單位疫苗的抗原設計則要花點心思，需要結合病原體的生物學、毒力和傳染性進行綜合考量。通常，決定病原體毒力的部分是比較理想的抗原，比如血凝素、刺突蛋白、失活的細菌毒素。優先選擇病原體不同突變株或亞株之間高度保守的序列，確保疫苗能最大范圍覆蓋盡可能多的病原體。當然，蛋白苗要注意所選擇的免疫原的獨特性和唯一性，避免選擇人體中有相似表位的免疫原。另外，蛋白苗要關注下表達或合成后是否與病原體表面的天然構象具備相同的空間結構，這也是蛋白苗的一個風險。
與蛋白苗不同的是，DNA和mRNA苗遞送到體內的是核酸序列。為了保持在血液中的穩定性以及方便細胞攝取，mRNA通常用脂質納米粒包裹后遞送。當然，mRNA疫苗除了將預期的RNA序列放入骨架中，也會加一些非標準核苷，以逃避先天免疫系統的攻擊。DNA疫苗的序列通常嵌入質粒或腺病毒中。mRNA也好，DNA也罷，最終都是將外源性蛋白在宿主細胞中表達，并啟動人體免疫反應。
佐劑
全病毒或細菌滅活、減毒疫苗，由于其中既包含預期免疫原，也包含很多其它微生物成分，在觸發機體先天和后天免疫方面要強于亞單位疫苗的。這就要提到佐劑的作用了。佐劑具備增強抗原的免疫反應、延長作用時間、調節免疫反應類型、保持抗原在注射位點的緩釋等作用。
雖然佐劑本身具備免疫刺激作用，FDA和EMA并不認為佐劑屬于制劑處方中的活性成分。原因是已上市的疫苗以鋁鹽佐劑為主，比如氫氧化鋁和磷酸鋁。這類佐劑已經使用了幾十年，已有很充分的安全性信息。不過，對于新型佐劑，安全性信息有限，或尚未有上市產品使用過，需要謹慎對待。不同監管機構對于新型佐劑的評價要求不完全一致。EMA要求新型佐劑原則上要在兩個種屬中（一個嚙齒類、一個非嚙齒類）獨立開展毒理學研究。WHO則認為只需要在一個毒理研究種屬中，額外設置一組佐劑對照組即可。
疫苗非臨床研究考量因素
1、供試品
理論上，用于非臨床毒理研究的疫苗、佐劑、含佐劑疫苗的批次應該與擬用于臨床試驗的一致，且應在GMP條件下完成的制備。當然，指導原則也留了一定靈活度。如果同批次樣品不易獲得，非臨床研究用樣品應該與臨床擬用樣品在生產過程、理化數據、制劑和穩定性等方面具有可比性。若是二者之間有明顯差異，則需要進行詳細的解釋說明。這點與傳統治療性生物制品要求類似，強調的還是擬用于毒理研究的樣品與臨床樣品的可比性，并不是嚴格要求一致。實操過程中，為了保障藥物開發進度，通常不會等臨床批次樣品生產且放行完再啟動毒理研究，與臨床樣品工藝和規模類似的工程批往往是首選。但是，對于生殖毒性研究，由于是在臨床階段平行開展的，建議還是使用臨床批次樣品。
如果供試品涉及到配制環節，如復融、混合等，需要在給藥前進行GLP條件下的供試品分析。但是，由于佐劑的存在，會吸附抗原，導致抗原濃度的分析有很大挑戰。疫苗開發企業最好提供預混好，不需要進一步處理的制劑，可以省去供試品分析環節。
關于疫苗的放行，過往大部分藥品監管機構要求開展一般毒性/異常毒性等確認是否有外源性有毒污染物。不過，美國和歐洲已經將這些研究內容去掉了，但國內、俄羅斯對這些實驗似乎還是有要求。
2、種屬選擇
疫苗毒理學研究種屬選擇的核心是動物能否對注射的抗原產生免疫反應。當然，如果所產生的免疫反應與人體類似是最理想的。但實際情況是，動物中的免疫反應，即使非人靈長類，往往是不能轉化到臨床的。WHO強調，所選擇的動物種屬一定要敏感。但無論如何，動物所產生的免疫反應跟人體還是有很大不同的。落到實操環節，大部分疫苗在毒理研究種屬中會考察下免疫原性。
大鼠和兔子是最常用的疫苗研究用種屬，具備體型小、成本低、免疫反應通常還不錯的優點。其它種屬如小鼠、豚鼠、非人靈長類、犬、小型豬、雪貂等也會考慮。
兔子：兔的免疫反應通常很強，是傳統的疫苗毒理學研究用種屬。兔可以按照人體給藥量（通常0.5mL）實現單點肌肉注射。此外，兔的血量比較多，可以在同一只動物中實現血液學、凝血、血生化、免疫學指標檢測。但是，用于檢測兔細胞免疫反應的試劑受限，再就是兔的臨床病理、組織病理學的歷史背景數據也有限。另外，兔被操作時的心臟相關指標變化特別敏感。兔子膽子非常小，很容易受驚或者被嚇死，是不是就是與心臟指標過于敏感有關，最后這句純屬猜測啊。
大鼠：相較于兔子，大鼠體型更小，更容易操作，也擁有大量的臨床病理、組織病理學背景數據，且各種免疫檢測試劑也很容易獲得。但臨床常用注射體積（如0.5mL）在大鼠中通常是不能單點注射的，一般要注射兩個位點。當然，可以基于mg/kg進行種屬間劑量換算。另外，大鼠血量有限，不能實現在同一只動物同時考察血液學、凝血、血生化和免疫學檢查，會增加參數間結果分析的復雜性。不過，大鼠在化藥、治療性生物制品等產品毒理研究中是主要嚙齒類種屬。故，很多公司基本也將大鼠作為疫苗毒理研究的主要種屬。
小鼠：小鼠在疫苗毒理研究中使用的比家兔或大鼠都要少。不過，很多疫苗的藥理學或藥效學研究都是采用小鼠開展的，這其實就沒有理由拒絕將其作為毒理學研究種屬。大鼠有的缺點，小鼠基本都是，包括采血量問題、劑量問題等。
非人靈長類：非人靈長類的體型允許肌肉注射給予完整的人體劑量，且同一只動物血量足夠完成所有計劃開展的檢測。非人靈長類的肌肉可以實現一些特殊的給藥裝置如電穿孔給藥。從倫理角度，只有在沒有其他相關動物可用的前提下，才能使用非人靈長類開展毒理研究。疫苗通常是外源性蛋白如來自病毒或細菌的組分，不存在與食蟹猴中蛋白更相似的情況，這點與傳統治療性生物制品如抗體，還是有很大區別的。因此，非人靈長類在疫苗毒理研究中用的不太普遍。
其它非臨床研究種屬
雪貂因對流感比較敏感，常用于流感疫苗的研究，既作為有效性研究種屬，也作為安全性研究種屬。豚鼠常用于局部耐受性研究或批放行中的異常毒性研究。小型豬的肌肉支持臨床注射劑量，且與人體具備相似的生理學、皮膚結構和免疫學特征。但小型豬的免疫學檢測試劑不易獲取，限制了其使用。犬對吐溫80過于敏感，而吐溫80又是疫苗制劑處方中的常用組分，而且犬的背景數據缺乏，免疫學檢測試劑也受限。
3、試驗組別設計
試驗組別至少包括生理鹽水對照組（或制劑buffer組）和疫苗組。如果疫苗中含有佐劑，且佐劑未在已上市疫苗中大量使用，則建議加設佐劑對照組。如果佐劑是諸如磷酸鋁和氫氧化鋁這種已有充分的研究數據且已在大量上市產品中使用，則不需要設置單獨的佐劑對照組。每組動物數量，WHO也給出了建議，對于大鼠或者小鼠，每組10雌+10雄即滿足要求。嚙齒類動物起始年齡在6-8周，兔子年齡在3-4個月。
4、劑量、注射體積及給藥部位
疫苗毒理研究理論上允許設置單個劑量水平，各個國家的指導原則均建議采用臨床最大擬用劑量給藥。比如2023年FDA批準上市的輝瑞的二價呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗ABRYSVO，非臨床一般毒理研究選擇大鼠240μg/天的單劑量設計（臨床最大擬用劑量為240μg/天）。不過，2020年FDA批準上市的Merck的人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗GARDASIL 9，非臨床一般毒理研究選擇大鼠低、中、高三劑量的設計。
給藥途經應模擬臨床擬用途徑。大部分疫苗臨床使用肌肉注射途徑給藥，也有皮內、皮下、鼻腔等給藥途經。
臨床肌肉注射常用體積為0.5mL，對于兔和體型大的動物是沒問題的，通常注射在后肢的股四頭肌。如果需要多次給藥，通常可以左、右側交替給藥。大鼠常用注射部位是股四頭肌，后肢的其它肌肉如股二頭肌、腓腸肌也可以使用。大鼠和其它嚙齒類動物，很難實現單點肌肉注射臨床擬用體積，畢竟大鼠肌肉最大注射體積不超過0.2mL。小鼠則更受限，每個肌肉注射位點不超過0.05mL。對于出現無法實現人體劑量給藥的情況，可以考慮增加抗原濃度，從而減少給藥體積。但是，這種策略并不常見，因為濃度的改變對免疫反應也可能有影響。
皮下給藥大部分注射部位在肩胛間區域、頸背側、肩部或側面，注射體積可以高達5mL/kg，也可以按照臨床擬用劑量和體積給藥，倒不會像肌肉注射那般受限。
鼻內給藥的疫苗直接將疫苗遞送至鼻腔粘膜。通常適用于流感病毒或呼吸系統相關病毒。疫苗鼻內給藥的主要優勢是既能誘導系統免疫，也能誘導局部/粘膜免疫。與其它給藥途經相比，會在局部產生更多的IgA抗體及明顯的細胞免疫。另外，鼻內給藥無創，不需要針頭注射，患者的依從性也會更好。但是，由于不同種屬鼻腔生理學差異，大鼠、犬、小鼠并不是合適種屬，非人靈長類如食蟹猴是推薦種屬。
5、給藥次數和給藥間隔
給藥次數至少要覆蓋臨床一年內預期給藥數量，通常建議N+1次（N為臨床給藥次數）。
動物毒理研究中的給藥間隔通常比臨床短，通常2-3周給藥1次。但如果臨床頻率小于2周，臨床前也需要模擬同樣頻率。通常末次藥后2-3天處死主試驗組動物，2-4周后處理后續恢復期動物。
6、評價指標
疫苗的毒理學評價指標大部分與其它生物制品類似，但也存在需要特別關注的點，包括局部毒性如注射部位反應；免疫反應如體溫、急性期反應蛋白及抗原特異性免疫反應等。
局部毒性：建議對疫苗給藥后注射位點進行評價，如紅斑和腫脹，通常通過評分實現。當然，不只疫苗，通常注射劑都會在重復給藥毒性試驗中伴隨考察局部刺激性，大部分產品沒有刺激性發生。但疫苗比較特殊，給藥局部有可能會出現免疫反應，所以需要重點關注。
臨床病理：疫苗的臨床病理檢測指標與其它藥物的要求大體是類似的，主要包括血液學、血生化、凝血和尿檢。當然，也有一些是疫苗這類產品需要特別關注的。比如與疫苗免疫反應相關的指標如急性期反應蛋白，如C反應蛋白（CRP）。CRP是人、兔、犬和猴種屬中常用的急性期反應指示蛋白，但是，在嚙齒類動物中，這一指標非常不敏感，反而會以α1-acid glycoprotein和α2-macroglobulin替代，所以要關注這些指標的種屬間差異。另外，疫苗有引起局部肌肉損傷的風險，可以關注肌酸激酶的變化。纖維蛋白原也是一個能反應機體炎癥和急性期反應的標記物，由于其基線濃度比較高（200-300mg/dL），小幅度的變化通常也是有意義的。另外，佐劑由于也是有免疫活性的，局部注射后引發的組織損傷及后續繼發的臨檢指標的變化有時不好區分是疫苗中的抗原引起，還是佐劑引起，這也是為什么新型佐劑要加設佐劑單獨對照組的原因。
免疫學檢測：免疫學檢測是疫苗的重中之重。疫苗選擇種屬的很重要的一個依據就是該種屬對疫苗中的抗原能產生免疫反應，而且最好免疫反應的類型和強度與人體可比。根據所選擇種屬的血容量，能在毒理主研究組采血最佳，實在血量無法滿足要求，可以考慮設置衛星組。采血點最好覆蓋給藥前、給藥結束和恢復期結束。檢測指標涵蓋細胞免疫和體液免疫。對于亞單位疫苗，如果里面含有多種不同抗原，最好能對每種抗原的免疫反應進行單獨檢測。
病理學檢查：疫苗的注射部位反應是非常常見的，而且與劑量不是特別相關，因此需要對注射位點及周圍引流淋巴結進行大體解剖和組織病理學檢查。其它大多數組織與常規毒理學研究的要求一致，并無太多特殊之處。
7、遺傳毒性和致癌性
疫苗抗原通常是生物制品，遺傳毒性通常不需要開展。但是，許多新型佐劑組分中可能含有新的化學成分，則需要對遺傳毒性進行考察。疫苗包括佐劑，通常不需要開展致癌性方面的研究。
8、組織分布研究
對于含有核酸成分的疫苗如DNA疫苗，存在DNA整合至宿主基因組的可能，從而提升癌變、基因組不穩定、細胞異常增殖等風險。佐劑成分中含有寡核苷酸如CpGs，也會存在類似擔憂。這類產品通常需要開展生物分布研究，探索疫苗核酸組分分布到哪些組織（如血、心臟、腦、肝臟、腎臟、骨髓、卵巢/睪丸、肺、引流淋巴結、脾臟、注射部位組織等），監測時間點從幾天到數月不等。檢測方法需要有足夠的靈敏度、特異性等。RNA疫苗也建議開展。
9、神經毒性研究
許多減毒的病毒疫苗，其活毒是具備潛在的神經毒性的。為確保減毒后，這一風險已經消失，需要對這類疫苗開展神經毒性方面的研究，確定這類疫苗是否在神經組織存在和復制。通常采用猴子開展研究，將病毒疫苗接種到動物丘腦或脊髓內，之后進行17-22天的臨床觀察，動物安樂死，在對腦、脊髓組織進行病毒特異性的組織病理檢查。如果用小鼠、大鼠進行這類試驗，最好與監管機構先行溝通。
10、生殖毒性研究
生殖毒性研究的主要目的是評價疫苗或因疫苗產生的免疫反應對胚胎、胎仔是否有影響。關于疫苗的生殖毒性要求在2006年FDA相關指南以及ICH S5（R3）中有介紹，感興趣的可以去詳細了解。如果疫苗有用于育齡婦女、妊娠婦女的可能，則需要在此之前完成發育和生殖毒性相關研究。生殖毒性研究所用供試品建議來自臨床擬用批次。所用動物種屬類似于常規毒理研究要求，需要對疫苗中的抗原產生免疫反應，嚙齒類和兔用的最多。通常僅選擇一個種屬進行考察即可。劑量方面的考量也類似重復給藥毒性研究，一般采用代表臨床劑量的單劑量即可。一般選擇在動物交配前即開始給藥，給藥貫穿整個妊娠周期，甚至有企業在動物哺乳期還在給藥，以確保動物體內產生足夠的抗體滴度和充分的毒性暴露。
來源：藥理毒理開發
