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雙熒光素酶基因報告系統（Dual Luciferase Reporter Assay System）是一種常用于評估基因調控元件（如啟動子、增強子或microRNA靶點）活性的實驗方法。該系統通常涉及兩個質粒的共轉染，其目的是為了提供更準確和可靠的實驗數據。這兩個質粒及其作用如下：

1. 報告質粒（Reporter Vector）：

這個質粒包含了待研究的調控序列上游的螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase, Fluc）基因。這個調控序列可以是啟動子、增強子或其他順式作用元件。

當細胞被轉染后，如果調控序列活躍，則會驅動螢火蟲熒光素酶基因的表達。通過測量螢火蟲熒光素酶的活性，我們可以間接了解目標調控序列的功能或活性水平。

2. 內參質粒（Control Vector）：

內參質粒通常攜帶海腎熒光素酶（Renilla luciferase, Rluc）基因，作為內部對照使用。它不受實驗處理的影響，并且在實驗設計中保持恒定表達。

海腎熒光素酶的作用是標準化實驗結果，以校正由于細胞數量差異、轉染效率變化或其它實驗條件波動帶來的影響。通過比較兩種熒光素酶的相對活性，可以獲得更加可靠的數據。

通過同時轉染這兩個質粒并檢測兩種不同類型的熒光素酶活性，研究人員可以得到關于特定調控序列功能的信息，同時確保實驗結果的穩定性和可重復性。這種方法廣泛應用于生物學研究中，尤其是在探索基因表達調控機制時。

一、基本實驗流程圖

二、實驗步驟

1、報告基因質粒構建：將目的片段插入到熒光素酶表達的報告基因載體上，如pGL3-basic、Psicheck-2等常見載體。通常是把目的基因結合區域或者基因轉錄的調控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上游，構建成熒光素酶報告質粒。

2、細胞培養與轉染：選擇合適的細胞系，如常用的工具細胞HEK293T等，用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37°C、5%CO?的培養箱中培養，待細胞密度達到70%~80%時進行轉染。

3、共轉染：將構建好的報告基因質粒和帶有海腎熒光素酶基因的內參質粒，按照一定比例使用脂質體轉染法等方法共同轉染入細胞。

以miRNA靶基因驗證為例 ：

4、細胞裂解：轉染后48h左右，去除培養基，用PBS清洗細胞1~2次，加入細胞裂解液，室溫裂解細胞15~30min左右，以保證細胞充分裂解。

5、熒光素酶活性測定：初次使用時，需配制Firefly Luciferase（螢火蟲熒光素酶）的底物，將其溶解在LARII buffer（Buffer 1）中，并分裝-80℃避光保存；同時現用現配Stop & Glo（Buffer 2），即Renilla Luciferase（海參熒光素酶）的底物，用于終止LARII buffer（Buffer 1）的反應。

6、檢測讀數：向一定量（如40μl）的LARII中加入適量（如10μl）細胞裂解液，吹打混勻后，立即用酶標儀檢測讀數，即為Firefly luciferase的值；接著加入等量的Stop & Glo，再次讀數，即為Renilla Luciferase的值。

7、數據處理與分析：計算每管的Firefly Luciferase/Renilla Luciferase的比值，再以control組的比值為單位，得到不同處理組的相對luciferase活性，以此來反映該處理組基因轉錄的調控活性。通常采用t檢驗或方差分析等統計方法進行數據分析，比較各樣品間相對熒光值的差異，判斷目的基因對熒光素酶活性的影響是否顯著。

8、結果分析和解讀：

（1）相對熒光素酶活性（Relative Luciferase Activity，RLA）的計算方法，即RLA=螢火蟲熒光素酶活性值（Fluc值）/海腎熒光素酶活性值（Rluc值）。以miRNA靶基因驗證為例 ：計算步驟步驟如下：

1.先計算出每孔的Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase的比值(F/R);

2.求出miRNA-Ctrl三個重復孔的平均值(average1)

3.再以miRNA-Ctrl組的average1為標準1進行標準化，即用miRNA mimic組的F/R三個重復值分別除以相對應組別average1得到三個比值

4.3.中求出的比值的平均值作為average2，并分別用average1和average2的值作柱狀圖

表1 歸一化數據處理

（2）以對照組為參照分析相對活性變化

1）雙熒光素酶活性升高：若實驗組的RLA值顯著高于對照組，例如對照組RLA為1，實驗組RLA為3，通常提示所研究的調控元件對報告基因（螢火蟲熒光素酶）的轉錄具有激活作用，即可能促進了目標基因的表達啟動或增強了表達水平。

2）雙熒光素酶活性降低：當實驗組的RLA值明顯低于對照組時，比如對照組RLA為1，實驗組RLA為0.5，則表明該調控元件可能抑制了報告基因的轉錄，使目標基因表達量相對減少。

3）無顯著差異：若實驗組與對照組的RLA值相近，且經統計學分析不存在顯著差異，說明在所設定的實驗條件下，該調控元件對目標基因轉錄可能沒有明顯的調控作用。

三、經驗總結

1、試劑準備與保存：螢火蟲熒光素酶底物LARII需按需分裝，-80℃避光保存，避免反復凍融；海腎熒光素酶底物Stop&Glo需現配現用。配好的LARII在-20℃可穩定一個月，在-70℃可穩定一年。

2、細胞轉染：注意轉染試劑的質量和使用說明，不同細胞系對轉染試劑的敏感性可能不同，可進行預實驗優化轉染條件，如轉染試劑的用量、細胞密度、轉染時間等。

3、設立陽性和陰性對照，以確保轉染的成功和實驗結果的可靠性。例如，可設置轉染空載體的陰性對照和已知有相互作用的陽性對照組合。

4、實驗操作過程：整個實驗過程要注意避光，尤其是在試劑配制、細胞裂解后以及熒光檢測過程中，防止熒光素酶底物見光分解影響檢測結果。

5、實驗操作盡量在短時間內完成，一般建議在30min內，以減少細胞裂解產物等在室溫下放置時間過長可能導致的活性變化。

6、樣品和測定試劑混合后到測定前的時間應盡量控制在相同時間內，通常1~2s，以保證檢測結果的準確性和可比性。

7、結果分析與問題排查：如果測量的熒光值較低，首先排除轉染效率問題，可通過在12孔板多鋪一孔細胞轉染熒光質粒，觀察轉染的熒光效率；若排除轉染問題后熒光讀值仍然較低，可以嘗試增加轉染質粒量。

8、若測量的熒光值過高，則可減少轉染質粒量，或者適當稀釋細胞裂解離心后的上清液。

9、若背景過高可能影響結果的準確性，需檢查試劑是否被污染、細胞是否有自發熒光等問題，并采取相應的解決措施。