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嘉峪檢測網 2025-01-10 19:07
北京大學深圳醫院骨關節科陳英奇副研究員、王德利主任和西南交通大學醫學院萬國江教授在科愛創辦的期刊Bioactive Materials上聯合發表文章：可降解鋅表面成血管-成骨耦合和抗破骨的金屬-有機/無機雜化涂層用于骨質疏松性骨折修復。該研究針對骨質疏松性骨折修復的難點，在可降解鋅金屬表面開發了一種唑來膦酸介導的硅酸鋅/鈣金屬-有機/無機雜化涂層。該涂層具有均勻的微/納米顆粒狀結構，可改善鋅基材腐蝕模式并降低其腐蝕速率，避免植入大鼠股骨骨折后的過早斷裂失效。該涂層可在較長時間內續釋放 Zn2+/Ca2+/Si4+和ZA分子，對血管化骨再生有顯著促進效果。改性的髓內釘通過內皮細胞和骨髓間充質干細胞之間的自分泌和旁分泌效應增強成血管-成骨耦聯作用，并抑制了破骨細胞活性。這種方法為可生物降解金屬的表面工程提供了一種新策略。
1. 研究背景
骨質疏松癥(OP)是一種常見的代謝性骨病，常發生于60歲以上的老年人。隨著全球老齡化的加劇，OP已成為一個重要的公共衛生問題。根據多中心流行病學調查預測，到2050年，OP患者將超過1.2億，給社會和患者帶來沉重的經濟負擔。OP的主要特征為骨微結構的破壞和骨量的減少，這導致骨骼脆性增加，骨折風險加大。因成骨活性受到抑制、血管生成能力受損以及破骨細胞活性亢進, OP患者的骨折修復困難。此外，OP患者的血液供應較差，血管數量較少，血小板內皮細胞粘附分子-1(CD31)和血管內皮生長因子(VEGF)表達水平較低。因此，OP骨折的治療需要調節成骨細胞和破骨細胞的功能平衡，并通過促進血管生成和成骨耦合來促進骨再生。
目前，OP骨折通常采用金屬骨植入裝置進行治療，如螺釘、鋼板、髓內釘(IMN)和克氏針等。然而，鈦合金(Ti6Al4V)、不銹鋼和鈷鉻合金等傳統惰性金屬制備的植入體存在一系列問題：如二次取出手術、機械性能不匹配和缺乏“血管生成-成骨-抗破骨”的生物功能。近年來，鎂(Mg)、鐵(Fe)和鋅(Zn)等可降解金屬因其臨時支撐和生物吸收特性受到關注，能夠有效規避上述問題。然而，Mg基植入物因腐蝕速度過快導致早期斷裂，Fe基植入物因降解速度過慢和腐蝕產物堆積而限制其在骨科的應用。而Zn因其適中的腐蝕速度、良好的機械性能和潛在生物活性，被認為是有前景的骨折固定材料。Zn作為人體重要的微量元素，參與多種生理活動，適量的Zn2+具有良好的生物功能，如抑制骨溶解，促進骨形成、礦化和血管生成。然而，Zn金屬易發生局部腐蝕，Zn2+的爆發式釋放、表面生物功能缺乏(尤其在血管生成-成骨-抗破骨耦合方面)限制了其在OP骨折修復中的應用。表面改性可以有效改善這些問題。
表面改性是調節Zn金屬腐蝕行為和提高生物相容性的常用方法。近年來，人們開發了從無機、到有機及復合材料的多種涂層類型，以對Zn生物金屬進行表面改性。例如，無機化合物包括金屬氧化物/氫氧化物(如ZrO2、ZnO、Zn(OH)2)、磷酸鹽(如ZnP、SrP和CaP)等；有機化合物包括膠原蛋白(Col)、聚多巴胺(PDA)和磷酸膽堿-殼聚糖；復合涂層則有加入膠原蛋白的CaP涂層、摻入雙膦酸鹽/氨基酸/蛋白質的ZnP涂層等。這些涂層能有效調控Zn基體的腐蝕行為和細胞相容性，但因成分結構簡單、缺乏針對性設計，無法滿足OP骨折修復的多功能需求。基于金屬有機/無機雜化涂層的多種成分、穩定的化學結構和可控釋放特性，有望提供血管生成-成骨-抗破骨的多功能涂層，滿足OP骨折修復的需求。
唑來膦酸(ZA)是一種常用于代謝性骨病患者的雙膦酸鹽(BP)，具有良好的抗破骨作用，是OP的首選治療藥物。然而，ZA全身性使用存在副作用，如腎損傷和非典型股骨骨折。局部應用ZA可在保持療效的前提下避免這些副作用。已有研究嘗試將ZA沉積在CaP涂層、聚合物溶液或ZnP復合涂層中，以緩解其全身性副作用。然而，目前的涂層系統難以實現ZA分子的可控持續釋放，并缺乏促進血管生成的功能，且ZA過高的局部濃度會抑制血管生成，影響骨折修復效果。因此，需要一種方法來實現ZA的可控釋放，防止抗血管生成作用，同時促進血管生成的恢復和骨壞死的預防。
在眾多生物活性陶瓷中，生物可吸收的硅酸鈣(CS)表現出較高的生物活性，能快速誘導骨狀磷灰石層的形成，促進良好的骨整合。CS基生物材料通常具有類似天然骨的分層結構，孔隙率和互連性適中，有利于骨傳導和血管生成。此外，硅離子通過激活ERK通路促進成骨和VEGF表達，進一步加速骨再生。然而，單一的CS涂層存在溶解快、易磨損等問題。引入具有螯合能力的生物活性分子如ZA，與CS形成雜化涂層，不僅可提高其穩定性、調節ZA的釋放，還可賦予其血管生成-成骨-抗破骨的多重生物功能，為OP骨折的愈合提供支持。
研究人員通過浸涂法在金屬Zn上構建了含ZA的硅酸鈣鋅(Ca(Zn)Si)金屬-有機/無機雜化涂層，ZA通過與PDA的氨基/酚羥基反應固定于預處理的Zn表面，Ca2+和Zn2+與ZA的膦酸基配位并誘導無機硅酸相沉積，形成Ca(Zn)Si涂層，并實現ZA的均勻分布和可控釋放(圖1)。通過實驗驗證了該涂層的形貌、化學成分及體外性能，采用轉錄組測序、RT-qPCR和蛋白質印跡(WB)分析了成骨和血管生成的分子機制，最后將該涂層的Zn基髓內釘植入大鼠OP骨折模型中，探討了其功能和生物降解行為。
圖1. ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層改性髓內釘的制備及其促進大鼠骨質疏性股骨骨折愈合示意圖
2. 重要研究結果
ZA&Ca(Zn)Si金屬-有機/無機雜化涂層表面呈現出微/納米級顆粒狀，涂層的主要元素為O、Si、P、Ca、Zn、C、N和P。ZA&Ca(Zn)Si涂層結構更緊湊，厚度較Ca(Zn)Si涂層薄，為19.8 ± 0.1 μm 。涂層的主要無機相為Zn3(PO4)2·4H2O、CaSiO3及CaZnSiO4。紅外光譜結果和X-射線光電子能譜證實了ZA分子成功摻入到涂層中。相比于純Zn，ZA&Ca(Zn)Si涂層具有更好的親水性和更高的表面能。膠帶和劃痕實驗測試結果顯示，ZACa(Zn)Si涂層具有較好的結合力(圖2)。
圖2. ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層的制備及材料表征
采用動電位極化(PDP)和電化學阻抗譜(EIS)測試探究純Zn和ZA&Ca(Zn)Si涂層改性Zn的腐蝕行為。根據PDP曲線，與純Zn相比，涂層改性Zn的陰極反應被顯著抑制。ZA&Ca(Zn)Si涂層樣品的自腐蝕電位(Ecorr)、自腐蝕電流密度(icorr)和腐蝕速率均低于純Zn和Ca(Zn)Si涂層樣品。ZA&Ca(Zn)Si涂層樣品的阻抗明顯高于純Zn和Ca(Zn)Si涂層樣品，擬合結果也表明改性涂層具有更高的表面涂層阻抗和界面轉移電阻。長期浸泡結果表明ZA&Ca(Zn)Si涂層樣品能夠誘導腐蝕產物均勻沉積、減緩了Zn2+的釋放、調控了Si4+、Ca2+和ZA分子的釋放。此外，該雜化涂層的致密結構有效阻隔腐蝕介質的滲入，防止了局部腐蝕和點蝕發生(圖3)。
圖3. ZA&Ca(Zn)Si金屬-有機/無機雜化涂層的體外腐蝕降解行為評價
通過對HUVECs轉錄組測序，探究ZA&Ca(Zn)Si改性鋅金屬促血管生成的潛在機制。在37895個基因中共有761個差異表達基因(DEGs)，其中583個上調，178個下調。與對照組相比，ZA&Ca(Zn)Si改性的樣品上調了一些與血管生成相關的典型基因，包括丙酮酸脫氫酶激酶1 (PDK1)和磷酸甘油酸激酶1 (PGK1)。PDK1是一種關鍵的糖酵解酶，主要分布在線粒體基質中，是HIF-1的下游靶基因之一。抑制 PDK1可能會降低HIF-1的表達，從而減少新生血管形成。PGK1 也是HIF-1的靶基因，參與血管形成。此外，成骨相關基因如轉化生長因子α (TGFA)在暴露于樣品提取物后上調。TGFA 是組織愈合的重要介質，在成骨中起關鍵作用。基于京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析，ZA&Ca(Zn)Si改性樣品浸提液上調了HIF-1和Wnt信號通路，它們對細胞生長、遷移和血管形成至關重要。基因集富集分析(GSEA)表明，ZA&Ca(Zn)Si 改性樣品提取物激活了 Notch 和鈣離子信號通路。WB分析進一步ZA&Ca(Zn)Si改性樣品浸提液促進了HIF-1和VEGF蛋白質的表達(圖4)。
圖4. ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層促血管生成的機制研究
為了深入了解 ZA&Ca(Zn)Si 涂層對成骨分化的潛在調控機制，對與該樣品提取物孵育的 BMSCs 進行了轉錄組測序。與對照組相比，35222個基因中有 2335個DEGs，其中573個基因上調，1762個下調基因。一些與成骨分化相關的典型基因上調，包括鋅指和同源盒蛋白(Zhx3)和骨調節蛋白(Omd)。Zhx3 通過調節下游基因，如 Runx2 和 osterix的表達參與成骨分化的初始階段。Omd是一種小蛋白多糖，分布在礦化組織(骨骼和牙齒)中，參與細胞粘附和骨礦化調節。與對照組相比，暴露于 ZA&Ca(Zn)Si改性樣品的提取物后，與新生血管形成相關的基因—VEGFD、血清/糖皮質激素調節激酶1 (SGK1)和谷氨酰胺合成酶(GLUL)上調。VEGF 是血小板衍生生長因子家族的一員，可促進內皮細胞生長和血管生成。SGK1是血管重塑過程中的必需酶，參與內皮細胞的生長、增殖和遷移。GLUL 是血管發育和內皮細胞遷移中必不可少的酶。這些血管生成相關基因的上調表明，BMSCs 可能通過旁分泌將這些蛋白質/酶釋放到周圍環境中，并作用于內皮細胞促進血管生成。GO 分析揭示了幾個生物過程、細胞成分和分子功能的富集。KEGG 富集分析表明絲裂原活化蛋白激酶(MAPK/ERK)、磷酸肌醇3-激酶-Akt (PI3K/Akt)、Wnt/β-catenin 和 Janus 激酶/信號轉導和轉錄激活因子(JAK/STAT)的富集，它們參與了成骨細胞增殖、分化、存活和成骨過程。WB結果證實了MAPK/ERK信號通路相關的蛋白在ZA&Ca(Zn)Si改性樣品浸提液的刺激下上調(圖5)。
圖5. ZA&Ca(Zn)Si金屬-有機/無機雜化涂層促成骨生成的機制研究
HUVEC 和 BMSC 之間的旁分泌作用，即血管生成-成骨耦合作用，對骨再生至關重要。使用 Transwell 共培養系統研究樣品浸提液作用下BMSCs對HUVECs的影響。結晶紫染色顯示，與純 Zn 和對照提取物相比，ZA&Ca(Zn)Si改性樣品中遷移的 HUVEC 更多。在 ZA&Ca(Zn)Si改性鋅的浸提液刺激下，形成了更多的網絡狀結構。進一步探究了BMSCs對HUVECs的旁分泌作用，與純 Zn 和對照組相比，ZA&Ca(Zn)Si組促進了更多的BMSCs遷移和ALP表達，表明具有更高的成骨分化能力。這些結果證實，在ZA&Ca(Zn)Si樣品浸提液的影響下，HUVEC 和 BMSC 之間的血管生成-成骨耦合顯著增強(圖6)。
圖6. ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層介導的成血管-成骨耦合作用
骨髓單核細胞(BMMs)是骨吸收實驗中常用的細胞模型，用于研究 ZA&Ca(Zn)Si 涂層樣品對破骨細胞增殖和分化的影響。與純 Zn、Ca(Zn)Si 涂層和對照樣品相比，ZA&Ca(Zn)Si 涂層樣品上的紫色TRAP陽性破骨細胞較少，破骨細胞活性更低且尺寸更小，且隨著ZA 濃度的增加，抗破骨細胞活性呈下降趨勢(圖7)。
圖7. ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層的抗破骨效應及機制
采用大鼠股骨骨質疏松性骨折模型探究ZA&Ca(Zn)Si改性的鋅基髓內釘促進骨再生的能力。采用的髓內釘尺寸為：長度28 ± 0.1 mm，直徑為1.6 ± 0.05 mm。術后24小時各組股骨斷端對位良好，髓內釘沒有發生位移，植入體周圍沒有感染。植入4周后，Ti6Al4V組觀察到明顯斷裂線，純Zn發生輕微的彎曲。植入8周后，Ti6Al4V組斷裂線仍然明顯，純Zn發生了嚴重的彎曲。術后16周，Ti6Al4V組髓內釘周圍出現較厚的骨痂，純Zn斷裂，植入失敗。ZA&Ca(Zn)Si髓內釘周圍骨痂被吸收，斷裂完全修復。定量數據愈合分數顯示，ZA&Ca(Zn)Si改性的鋅基髓內釘具有最高評分。Micro-CT 圖像顯示出與 X 射線相同的結果。植入后 16 周，ZA&Ca(Zn)Si 涂層改性的鋅基髓內釘幾乎完全修復的骨折。骨密度(BMD)、骨體積占總體積的百分比(BV/TV) 、骨小梁數量(Tb. N)和骨小梁厚度(Tb. Th)與骨折愈合評分表現出相同的趨勢。此外，ZA&Ca(Zn)Si涂層改性的鋅基髓內釘顯示出最低的骨小梁間隔(Tb. Sp)。這些結果表明，ZA&Ca(Zn)Si涂層改性的鋅基髓內釘加速了骨質疏松性骨折的愈合(圖8)。
圖8. ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層改性鋅基髓內釘在大鼠骨質疏松性股骨骨折模型中的X射線和Micro-CT結果
通過H&E、Masson、Goldner和免疫組織化學染色評估骨再生。H&E染色顯示Ti6Al4V組中有一條清晰的骨折線。在純 Zn組中，由于髓內釘過早骨折導致骨折愈合不良，出現大量新形成的纖維組織。Ca(Zn)Si改性的髓內釘這組也出現骨折線。相比之下，ZA&Ca(Zn)Si組表現出相對不明顯的骨折線，靠近骨折部位的膠原蛋白分化為新的小梁骨，表現為紫色的蜂窩狀組織，表明愈合狀態良好。Masson染色顯示， Ti6Al4V組的骨折部位處幾乎沒有新形成的膠原蛋白。在純 Zn組中，斷裂末端由豐富的膠原纖維連接。Ca(Zn)Si改性的髓內釘組發現部分礦化膠原蛋白。ZA&Ca(Zn)Si改性髓內釘組染成深紅色，表明更多的礦化骨形成。Goldner染色顯示了類似的結果，與其他三組相比，ZA&Ca(Zn)Si改性髓內釘組有更多的礦化新骨染成綠色，這意味著骨愈合更好(圖9)。
圖9. ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層改性鋅基髓內釘促進大鼠骨質疏松性股骨骨折染色結果
總之，ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層對修復骨質疏松性骨折表現出非凡的療效。基于ZA 和 Ca2+和Zn2+的配位與無機相的原位形核生長成功制備了ZA介導的Ca(Zn)Si 雜化涂層，該涂層具有致密的顆粒狀微/納米結構。與純 Zn 和 Ca(Zn)Si 改性樣品相比，ZA&Ca(Zn)Si 涂層調節了鋅的腐蝕模式并降低了其腐蝕速率，防止了體內過早斷裂失，并維持了活性物質的持續釋放。雜化涂層通過多種信號通路和耦聯效應調節細胞反應，Zn2+、Ca2+ 、Si4+和ZA 協同作用促進了HUVECs和BMSCs的增殖和分化。這些活性物質進一步增強了HUVECs 和BMSCs之間的旁分泌作用，調節血管生成-成骨耦合并加速早期血管形成和成骨分化，創造了一個合適的骨愈合微環境。此外，雜化涂層釋放的Zn2+和ZA分子抑制了破骨細胞的分化。綜上所述，本研究為開發用于骨質疏松性骨折的內固定植入物提供了一定基礎。
原文信息
Junyu Qian#, Haotian Qin#, En Su, Jiaming Hou, Hui Zeng, Tianbing Wang, Deli Wang*, Guojiang Wan*, Yingqi Chen*. Angiogenesis-osteogenesis coupling and anti-osteoclastogenesis zoledronate intermixed calcium silicate metal-organic/inorganic hybrid coating on biodegradable zinc-based intramedullary nails for osteoporotic fracture healing. Bioactive Materials, 44 (2025) 46-67.
DOI:https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.09.041
來源：Internet
