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嘉峪檢測網 2025-02-17 09:04
GPX4（谷胱甘肽過氧化物酶4）是一種非常重要的抗氧化酶。GPX4主要通過催化GSH（谷胱甘肽）還原各種過氧化物（如過氧化氫H?O?、脂質過氧化物），將其轉化為相應的醇和水，從而保護細胞免受氧化應激損傷。
GPX4在細胞的抗氧化防御、疾病發生發展以及治療策略等多個方面都發揮著重要作用，是目前研究的熱點之一。特別是在鐵死亡研究方面，GPX4是重要的檢測指標之一。
因此，通常地GPX4酶活性測定具體步驟如下：
一、實驗步驟
1.樣本制備
（1）原理：首先需要從細胞或組織中提取蛋白質，以便后續測定GPX4酶的活性。GPX4是一種含硒的蛋白質，其活性依賴于細胞內的生理環境和合適的緩沖條件。
（2）操作步驟：
1）細胞樣本：
將狀態良好的細胞鋪至孔板中，特定實驗處理后用胰蛋白酶消化收集細胞，800~1500rpm離心5min，棄上清，用預冷的PBS洗滌細胞2~3次，以去除培養基等雜質。
加入適量的細胞裂解液如含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑RIPA裂解液，防止蛋白質降解和磷酸化狀態改變，冰上裂解30min左右，期間可輕輕振蕩或渦旋，使細胞充分裂解。
裂解后，4℃，12000rpm離心15min，取上清即為蛋白提取液，可使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白濃度進行定量。
2）組織樣本：
取新鮮組織，迅速放入液氮（-196℃）中冷凍，然后在研缽中研磨成粉末狀，可加入液氮防止組織解凍。
加入適量的組織裂解液（如上述RIPA裂解液），在冰上繼續裂解30~60min，期間不時攪拌。
4℃，12000rpm離心15min，取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。
2.反應體系設置
（1）原理：GPX4可以催化谷胱甘肽（GSH）與過氧化氫（H?O?）的反應，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）和水。通過檢測GSH的減少或GSSG的生成量，可以間接反映GPX4的活性。反應體系中還會加入一些輔助試劑，以保證反應的順利進行。
（2）操作步驟：一般在96孔板或微量離心管中進行反應，以下是一個典型的反應體系（示例，可根據實際情況調整）：
加入適量的蛋白樣品（根據BCA定量結果調整，使反應體系中總蛋白量在一定范圍內，如10~50μg）。
加入反應緩沖液，如50mM Tris-HCl（pH7.5）、1 mM EDTA、5 mM NaN?等，為GPX4提供合適的反應環境。加入谷胱甘肽還原酶（GR）和NADPH，GR可將GSSG還原為GSH，NADPH為其提供還原力，保證GSH的循環利用，維持反應持續進行。
加入一定量的GSH和H?O?，啟動反應。對于微量離心管，反應總體積一般為100~200μL；對于96孔板，每孔體積可根據板的規格調整，如200μL或100μL。
3.反應檢測
（1）原理：可以通過檢測NADPH的消耗來反映GPX4的活性，因為在反應過程中，NADPH被氧化為NADP?，其在340nm處的吸光度會下降。
（2）操作步驟：
將反應體系置于37℃的恒溫箱或酶標儀中，利用酶標儀的動力學模式，在340nm處連續監測吸光度的變化
記錄初始吸光度值（A?）和一定時間內（如5~10min）的吸光度變化（ΔA）。
4.酶活性計算
（1）原理：根據吸光度的變化，利用朗伯-比爾定律（A=εbc，其中A為吸光度，ε為摩爾吸光系數，b為光程，c為物質的量濃度）計算GPX4的活性。
（2）操作步驟：
首先根據NADPH的摩爾吸光系數（ε=6.22×10³M?¹cm?¹）和光程（b，一般為1cm或根據實際使用的比色皿或酶標儀確定）計算NADPH的消耗速率（Δc/Δt）。
酶活性單位通常定義為每min催化1 μmol NADPH氧化所需的酶量，根據反應體系中蛋白的量和時間，計算GPX4的酶活性，公式如下：酶活性（U/mg蛋白）=[（ΔA×V）/（ε×b×t×m）]×稀釋倍數。其中V為反應體系體積，t為反應時間（min），m為反應體系中蛋白的質量（mg）。
二、注意事項
1.樣本處理：樣本在提取過程中要盡量保持低溫，防止蛋白質變性和酶活性喪失。裂解液中加入的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑要保證有效，避免GPX4被降解或其磷酸化狀態被改變，影響酶活性。
2.反應體系：反應緩沖液的pH值要準確，因為GPX4對pH敏感，一般最適pH在7.0~8.0之間。加入的各種試劑要新鮮配制或保存在合適的條件下，如NADPH易氧化，應現用現配或在-20℃保存，使用時避免反復凍融。
3.酶標儀設置：確保酶標儀波長設置準確，在340nm處檢測吸光度。對于動力學模式，設置合適的測量時間間隔和總時長，以準確記錄吸光度的變化。
4.對照設置：要設置空白對照，使用不含蛋白樣品的反應體系，排除試劑本身的干擾。可設置陽性對照，使用已知活性的GPX4標準品或已知GPX4活性的樣本，驗證實驗體系的可靠性。
5.數據分析：進行多次重復實驗，計算平均值和標準差，以保證數據的準確性和可靠性。若結果異常，可檢查樣本提取、反應體系、酶標儀操作等環節是否出現問題，通過逐步排查找到問題所在。
來源：實驗老司機
