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嘉峪檢測網 2025-03-12 18:27
近期，河北醫科大學第三醫院陳偉團隊和中科院深圳先進研究院潘浩波、崔旭團隊貴州省人民醫院任有亮博士在科愛創辦的期刊Bioactive Materials上聯合發表文章：針對復雜植入物相關骨感染面臨的致病菌難清除、感染性骨破壞修復難度大、抗生素骨水泥藥物有效率低以及潛在組織毒性等問題，本研究課題組將硼硅酸鹽生物活性玻璃（BSG）負載低劑量硫酸慶大霉素PMMA骨水泥用于植入物相關金葡菌骨感染研究。研究發現：BSG對細菌ATP合成具有明顯抑制作用，強化了極低GS劑量的殺菌效率與對金葡菌生物膜清除效用，同步實現了局部骨整合。這不但提升了抗生素有效利用率，還降低了抗生素所致細菌耐藥與毒性。
骨感染是臨床骨科災難性并發癥之一。作為骨髓炎的標準療法，負載抗生素的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥對感染病灶中生物膜包裹的細菌殺傷能力極為有限。此外，高劑量抗生素植入物易造成細菌耐藥、全身系統性毒性和組織愈合受損等風險。本研究通過將硼硅酸鹽生物活性玻璃（BSG）摻入低劑量硫酸慶大霉素（GS）負載的PMMA骨水泥中，提出了一種協同根除細菌并實現順序性骨整合的智能策略。結果表明，BSG摻入不僅保持了PMMA骨水泥的臨床使用性能，還賦予其離子和堿性微環境營造特性。BSG降解所營造的微環境可破壞細菌細胞壁和膜完整性，并通過抑制細胞膜上電子呼吸鏈抑制細菌ATP合成，同時削弱細菌抗氧化成分（過氧化物酶體和類胡蘿卜素），使胞內活性氧（ROS）水平大幅提升。同時，BSG聯合GS自身抗菌機制（與核糖體的30S亞基結合，抑制翻譯過程），使細菌ATP合成抑制和氧化應激加強，從而實現了遠低于GS臨床使用劑量下對骨感染病灶內細菌殺滅和生物膜清除。此外，從PMMA植入物中釋放出的GS、生物活性離子以及構建的局部弱堿性微環境，還可協同促進hBMSCs成骨表達，進而實現感染微環境下局部骨整合與成骨再生。因此，本研究通過對PMMA中摻入BSG，提出一種可減少臨床抗生素劑量和提升植入物抗菌活性與成骨性能的治療復雜金葡菌骨感染策略。此策略有望有效解決細菌耐藥性、感染性骨缺損的修復難題。
圖1.（a）硼硅酸鹽生物活性玻璃和生物活性抗菌骨水泥的制備。EDS成像圖像顯示BSG在PMMA內均勻分布。（b）將生物活性抗菌骨水泥植入感染性股骨髓腔實現抗菌與促成骨示意圖。（c）生物活性抗菌水泥的抗菌機制。（d）生物活性抗菌骨水泥的成骨效應示意圖。
一．生物活性抗菌PMMA骨水泥的制備與表征
本研究采用熔融法制備了硼硅酸鹽生物活性玻璃（BSG），傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）與X射線衍射（XRD）顯示：BSG顆粒為非晶態硼氧和硅氧雙重網絡結構。在PMMA中摻入BSG后，PMMA固化過程溫度略降低。同時，骨水泥可操作時間符合外科植入物丙烯酸樹脂骨水泥的國際標準（ISO 5833:2002）（不超過15分鐘）。由于BSG降解導致PMMA基材內微孔增加，使摻入BSG的PMMA水泥機械性能輕微下降。值得注意的是，在浸泡過程中，B/G/PMMA組始終顯示更高 pH值、離子累積濃度和GS濃度，說明BSG和GS能相互促進各自從生物活性抗菌骨水泥的釋放。
圖 2.（a）BSG顆粒的SEM（白色標尺=5μm；黑色標尺=2μm）。（b）B/G/PMMA骨水泥的斷面微觀形貌（白色比例尺=50μm；黑色比例尺=20μm）和（c）B/G/PMMA骨水泥表面的EDS（比例尺=100μm）。骨水泥操作時間（d）、抗壓強度（e）和四點彎曲強度（f）。骨水泥在PBS浸泡不同時間后抗壓強度（g）和四點抗彎強度（h）的變化。骨水泥在PBS浸泡不同時間后，PBS的pH值變化曲線（i），（j）BO3³?的累積釋放，（k）Ca²?的累計釋放及（l）硫酸慶大霉素（GS）的累積釋放。
二．生物活性抗菌PMMA骨水泥體外抗菌性能評價
其次，本研究評估了生物活性抗菌骨水泥對金黃色葡萄球菌活性、生物膜形成、形態結果影響。結果表明，BSG的離子與堿性微環境，以及GS的釋放，能協同強化骨水泥的細菌殺傷和生物膜清除效應。
圖3.（a）金黃色葡萄球菌菌落圖像和（b）定量分析。（c）使用Alamar Blue試劑（激發波長：560 nm；發射波長：590 nm）檢測樣品表面培養6小時后檢測金黃色葡萄球菌的活性。（d）培養6小時后的金黃色葡萄球菌的活/死染色（比例尺=75μm）和（e）形態（比例尺=2μm）。
三．金黃色葡萄球菌與骨水泥共培養后的轉錄組學分析
為明確生物活性抗菌水泥的抑菌機制，本研究進行了轉錄組測序研究，RNA-Seq結果顯示，將生物活性抗菌水泥暴露于細菌環境后，生物活性抗菌水泥可立即部分釋放所負載的GS，并逐步營造由BSG降解產生的離子和堿性微環境。細胞外高滲透離子環境首先可破壞細菌壁膜結構完整性，同時堿性微環境隨后干擾細胞膜上呼吸鏈、破壞細菌ATP合成，有效降低細菌損傷耐受性，抑制細菌菌落發育及其生物膜形成。隨著細胞壁膜破壞加重，積聚在細胞外的GS大量進入金黃色葡萄球菌胞內，使細菌活性受到嚴重抑制，進而發揮深層次抗菌作用。
圖 4. 火山圖顯示PMMA和B/PMMA組（a）間以及B/PMMA和B/G/PMMA組（B）之間的基因表達差異。（c）差異表達基因的維恩圖。（d）通過基因集富集分析（GSEA）分析PMMA和B/PMMA組之間金黃色葡萄球菌的跨膜轉運、離子轉運、膜組成部分和跨膜轉運蛋白活性。（e）使用京都基因和基因組百科全書（KEGG）分析比較PMMA和B/PMMA組之間金黃色葡萄球菌的上調基因和（f）下調基因。（g）使用KEGG分析比較B/PMMA和B/g/PMMA組之間金黃色葡萄球菌的上調基因和（h）下調基因。（i-k）蛋白質相互作用（PPI）網絡圖顯示的生物過程間聯系。
圖5.（a）熱圖分析組間差異基因表達。通過蛋白質濃度測試（b）和鄰硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）測定（c）檢測膜通透性。（d）生物膜結晶紫染色和（e）在562 nm下的定量分析。（f）595 nm處的ATP定量分析。（g）通過2,7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）檢測活性氧（ROS）水平與其定量分析，激發波長：480 nm，發射波長：525 nm，比例尺=50μm。
四．hBMSCs與骨水泥共培養后成骨分化體外評價
本研究還發現BSG降解釋放的離子、堿性微環境及低濃度抗生素刺激也有利于hBMSCs的細胞活化，進而顯著促進了hBMSCs在體外存活、增殖和成骨分化，同時促進早期（RUNX2）、中期（ALP）和晚期（OCN）成骨基因表達顯著上調，提示本研究所構建生物活性抗菌PMMA骨水泥在完成初步抗菌任務后可以順序增強骨整合，且在體內無任何生物毒性。
圖6.（a）共培養1天、3天和5天后hBMSCs的細胞毒性和增殖。（b）在24小時后hBMSCs的活/死（比例尺=200μm）和細胞骨架染色（比例尺=50μm）。（c）共培養模式示意圖。（d）hBMSCs的堿性磷酸酶（ALP）染色，比例尺=50μm。（e）培養7天后細胞培養基中ALP定量分析。（f）共培養14天后，hBMSCs的茜素紅S（ARS）染色，比例尺=50μm。（g）hBMSCs的ARS染色定量分析。在共培養7天后的（h）堿性磷酸酶（ALP）和（i）runt相關轉錄因子2（RUNX2）基因表達。（j）在共培養14天后的骨鈣素（OCN）和骨橋蛋白（OPN）基因表達。（l）在共培養7天和14天后hBMSCs的RUNX2和OCN蛋白表達。
五．骨水泥抗菌活性、骨整合和生物相容性的體內評價
為進一步檢測所構建生物活性抗菌水泥對植入物相關金葡菌骨感染的治療效果，本研究通過構建植入物相關金葡菌骨感染模型，并植入不同性質的植入物進行治療，待感染形成1周和2周后，單純PMMA組實驗動物金葡菌感染性股骨髓腔內可見大量菌落。與負載GS的PMMA水泥相比，摻入BSG的生物活性抗菌水泥治療組顯示出優異抗菌活性。X射線顯示，PMMA骨水泥組表現出明顯骨感染和骨膜反應，而B/G/PMMA組僅顯示出輕微骨膜反應。組織學H&E染色顯示，除B/G/PMMA組外，PMMA、G/PMMA和B/PMMA組髓腔內有大量炎性細胞浸潤，革蘭氏染色進一步證實，PMMA、G/PMMA和B/PMMA組可見大量金黃色葡萄球菌定植于骨細胞腔隙小管網絡（OLCN）和髓腔內感染性死骨中。Masson染色證明，B/G/PMMA植入物周圍大量膠原蛋白形成。上述綜合證明，生物活性抗菌水泥具有優異的抗菌作用，可清除定植在骨小管和死骨中金黃色葡萄球菌。植入后4周和8周，Micro-CT結果顯示，B/PMMA和B/G/PMMA植入物周圍的新骨形成明顯，形成殼結構。G/PMMA骨水泥植入物周圍只觀察到一定量的松散和無定形骨組織，骨參數分析顯示，B/G/PMMA組新生骨量最高。
圖7.（a）體內實驗設計。（b）植入后1周瓊脂平板法下菌落形成。（c）瓊脂平板法菌落定量分析。（d）使用細菌培養法（OD=600nm）評估植入后1周抗菌效果。（e）植入1周和2周后金黃色葡萄球菌感染的大鼠股骨病變X射線照片。（f）X射線評分直方圖。（g）植入2周后的蘇木精-伊紅（H&E）染色、（H）革蘭氏染色和（i）Masson染色。
圖8. （a）植入8周后大鼠股骨的矢狀面和三維重建圖像。（b）植入后8周骨參數分析，包括骨體積/總體積（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁數量（Tb.N）。（c）植入4周后H&E染色、（d）革蘭氏染色和（E）Masson染色。比例尺=200μm。
總之，本研究將BSG負載于低劑量抗生素PMMA骨水泥，為有效解決植入物相關金黃色葡萄球菌骨感染所面臨的致病菌清除以及感染性骨缺損修復提供了一種極具前景的策略。研究發現：BSG的加入不僅維持了PMMA的優良機械特性，還可提升PMMA骨水泥生物活性，使其抗菌性大幅改善。機制上，BSG降解損傷了細菌壁膜完整性，降低抗氧化組分（如類胡蘿卜素）活性，并阻礙細菌ATP合成。此外，BSG和低劑量GS還可協同促進hBMSCs體內外活性、粘附、增殖和成骨分化。本研究初步驗證摻入了BSG的抗生素PMMA骨水泥對金葡菌骨感染的抗菌潛能及骨誘導特性，此研究成果可為進一步解決臨床難治性金葡菌骨感染所面臨的病原菌清除和感染性骨缺損修復等問題提供重要參考。
原文信息
Fan M, Ren Y, Zhu Y, Zhang H, Li S, Liu C, Lv H, Chu L, Hou Z, Zhang Y, Pan H, Cui X, Chen W. Borosilicate bioactive glass synergizing low-dose antibiotic loaded implants to combat bacteria through ATP disruption and oxidative stress to sequentially achieve osseointegration. Bioact Mater. 2024 Oct 18;44:184-204.
doi: 10.1016/j.bioactmat.2024.10.009.
PMID: 39502840;
PMCID: PMC11535878.
來源：Internet
