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嘉峪檢測網 2019-10-11 15:43
1、摘要
本文探討性講述了在進行原料藥含量測定、原料藥雜質定量測定、化藥制劑含量測定、化藥制劑雜質定量測定、化藥制劑溶出度測定和中成藥主成份含量測定的方法驗證時，回收率考察的各種方法；如何去設計實驗更合理，更能滿足真正意義上的準確度要求；如何真正搞明白回收率考察的方法和意義。
回收率是表示測定方法準確度的直觀指標，指采用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度。任何分析方法，只要是定量測定，都必須滿足一定的準確度要求，這是保證分析方法所測定數據可靠性的基本準則。對于藥企的分析工作者，經常接觸的是原料藥、化藥制劑和中成藥相應的定量測定。筆者根據過往經歷、所見所聞及國內外指導原則，分別就這幾方面談一談回收率考察的各種方法。
2、原料藥含量測定
15版藥典9101“藥品質量標準分析方法驗證指導原則”：原料藥采用對照品進行測定，或用本法所得結果與已知準確度的另一個方法測定的結果進行比較。也可由所測定的精密度、線性和專屬性推算出來。
ICHQ2中提及了三種方法。這三種方法與上述指導原則如出一轍，顯然，CDE完全借鑒了ICH的指導原則。
幾種回收率考察方法：
由所測定的精密度、線性和專屬性推算出來。其實仔細想一下精密度項下的“重復性”，有種方式也是設計3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品測定，用9份樣品的測定結果進行評價。如此，對于原料藥，重復性考察不就是回收率考察嗎。因此，無需驗證準確度。
用本法所得結果與已知準確度的另一個方法測定的結果進行比較。如原料含量的藥典方法為滴定法（容量法），則開發的HPLC含量測定方法，其測定的結果與容量法比較，回收率% = HPLC含量/容量法含量×100%。
用對照品配制80%、100%和120%濃度的樣品(含量測定時供試品原料的濃度作為100%濃度)，各個濃度平行配制三份，共九份樣品。測得樣品的峰面積，按照分析方法規定的計算方法計算（單點外標或多點外標），求得相應的量，作為測得量。配制樣品時的稱量作為加入量，回收率% = 測得量/加入量×100%。
加標法，類似化藥有關物質雜質加標的方式，分別加入相對于供試品原料濃度的80%、100%和120%的對照品，每個濃度平行試驗三份，共九份樣品。回收率% = （測得量-樣品中量）/ 加入量×100%。
上述幾種方法，筆者更傾向于前三種方法，其中第二種最可靠，畢竟是采用兩種不同原理方法測定結果的比較。
3、原料藥雜質定量測定
回收率% = （測得量-樣品本底）/ 加入量×100%。
注意，定量限濃度的回收率筆者認為還是必須要做的，有些公司這個濃度沒有去考察。既然是“定量”限，就得滿足一定的準確度要求，定量限濃度也要能準確定量，尤其當報告限等于定量限時，更得考察了。
曾經聽到過這樣的疑問，例如樣品本底中雜質A的限度為0.5%，本底中的量為0.2%（本底量為限度的40%），加入限度的50%、100%和150%雜質對照品后，樣品中的雜質A總量為0.45%、0.7%和0.95%，這樣驗證的實際濃度是限度的90%、140%和190%，那是不是需要在加標的時候考慮本底的量使加入后總量為限度的50%、100%和150%？此例加入量就變為加入限度的10%、60%和110%。
筆者認為，完全沒有必要這樣做，這種加標回收，測定的是加入量的回收率，如加入限度的50%，如回收率100%的話，那應該能回收限度50%的量。從回收率的計算公式“（測得量-樣品中量）/ 加入量”，顯然也是對“加入量”的回收率。況且，我們選取的這幾個濃度，代表了一個濃度范圍，也就是說我們驗證了一個濃度范圍，在這個范圍內回收率均是可以接受的。只不過在進行線性考察時，線性范圍要盡量寬，至少應覆蓋回收率考察的濃度范圍，此例的線性考察范圍就應該是定量限濃度～限度濃度的2倍。
4、化藥制劑含量測定和雜質定量測定
化藥制劑的含量測定和雜質定量測定的回收率考察，如果按照指導原則，其實都算是空白輔料加標。（注：2020版藥典方法驗證指導原則征求意見稿中，對于化藥制劑，含量測定除了空白輔料加標，還可制劑加標；雜質測定已改成制劑加標）
化藥制劑含量測定，是將對照品或原料加入空白輔料中，加入量為80%、100%和120%，考察在原料與輔料共存時，方法能檢出其中主藥的能力，每個濃度平行試驗三份，其中每份空白輔料量是制劑處方中輔料占比的量，樣品處理方式同供試品處理方式。
化藥制劑雜質定量測定回收率的一種方式，是將雜質對照品加入制劑供試品中，一般加入濃度分別為定量限濃度、限度的50%、限度的100%和限度的150%。每個濃度平行配制三份，分別計算每個濃度平行樣品回收率的RSD和共計12份樣品回收率的RSD。回收率% = （測得量-樣品本底）/ 加入量×100%。
化藥制劑雜質定量測定回收率的另一種方式，是將雜質對照品加入空白輔料中（該法適用于供試品本底雜質含量較高的品種），加入量同上，回收率% = 測得量/加入量×100%。
5、化藥制劑的溶出度測定
試驗時一般將稱量的樣品置容量瓶中進行考察；也有將稱量的樣品置溶出杯中進行考察的；甚至還有將原輔料按處方比例稱量，混合后裝入膠囊，再將膠囊置溶出杯中進行考察，那片劑怎么辦？難道還要將原輔料按處方比例稱量，混合后壓片嗎？藥檢所進行質量標準復核時，一般是采用第一種方式，也曾聽北京藥檢所的某位老師說溶出度的驗證是針對溶出量的檢測方法（如HPLC法）進行考察。如果針對溶出度測定方法（跟溶出儀相關）進行驗證，那模擬樣品是絕對不可能完全模擬實際樣品的，實際樣品中的原輔料還要經過一系列工藝過程呢。筆者更傾向于第一種方式，第二種方式也曾經采用過（特殊情況下），審評中心的卡培他濱片CTD案例也是采用第一種方式。
6、中藥材或中成藥主成份含量測定
7、回收率的引申概念
回收率的引申概念，生物樣品的測定，如血漿樣品中主藥測定的方法驗證引入了相對回收率和絕對回收率的概念，我們平時所說的回收率大部分是指絕對回收率。對于血樣的絕對回收率，相當于血樣中主藥的提取率，一般都很低，要求50%以上即可。相對回收率的一般做法，在空白血漿中加入系列濃度的對照品儲備溶液，制得校正曲線；在空白血漿中加入低、中、高濃度的對照品儲備溶液，制得模擬含藥血樣，模擬血樣中的主藥含量通過校正曲線計算得到。回收率% = 測得量/ 加入量×100%，如此測得的相對回收率比絕對回收率數據好看多了，接受標準為80～120%，一般都能做到95～105%。服藥采血后的血樣當然也是通過校正曲線（基質加對照品儲備液）計算其主藥濃度。通過此例，可以看出，由于血漿中主藥的提取率很低（絕對回收率），因此對照品溶液也同樣加入空白血漿處理，這樣就消除了提取率低的問題，也相當合理。鑒于此，筆者有個大膽想法，我們平時遇到樣品基質很復雜的制劑，提取率怎么處理都很難提高，像這種樣品，我們不妨可以采用相對回收率的處理方式，這樣可以解決由于基質對樣品的吸附作用而造成的絕對回收率低的問題。
本文僅代表個人觀點和感悟，如有不當之處，還望各位同仁多多包涵。
參考文獻
[1] 2015版藥典四部9101. 藥品質量標準分析方法驗證指導原則.
[2] ICH Q2. VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES: TEXT AND METHODOLOGY.
[3] CDE. 化學藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則.
[4] 2020版藥典四部9101. 藥品質量標準分析方法驗證指導原則的征求意見稿.
來源：藥事縱橫
