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嘉峪檢測網 2022-07-12 16:20
摘要: 《中國藥典》2020 年版三部“生物制品生物活性/效價測定方法驗證指導原則”( 通則 9401) 是國內首個適用于生物制品生物活性/效價測定方法驗證的指導原則，彌補了國內缺少針對生物活性方法驗證指導原則的空白。為正確理解和執行該指導原則，推動國內生物活性/效價測定方法驗證工作的規范化，本文從該指導原則的新增背景、起草過程、國內外藥典比較和主要內容解讀等幾方面進行了闡述，并對未來該通則內容的完善進行了初步展望，旨在為廣大從業人員提供指導性建議及參考。
生物活性/效價是藥品產生特定生物學效應的能力，是評價藥品有效性最關鍵的質量指標。根據分析方法手段不同，生物活性/效價測定方法包括基于整體動物、離體組織、細胞和微生物等生物體的體內外生物活性測定法、免疫化學方法、酶反應試驗、結合試驗等。生物活性/效價測定主要可用于原液及成品的批放行、穩定性評價、標準品及其他關鍵試劑質量的確認、工藝中間體及處方制劑的表征、污染物及降解產物等雜質的表征，以及為產品生產工藝變更提供依據。
對生物活性或效價測定法進行充分的驗證是保障其適用性的重要前提。《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》) 截止 2015 版的歷版已收載了 30多種生物活性/效價測定方法( 通則 3500) ，但涉及生物活性/效價測定方法驗證的相關技術指南均為空白。目前國際上可參考的相關技術指南和指導原則為數較少，且要求尚未統一，總體上以美國藥典( USPNF 2021) 收載的“biological assay validation( 生物檢定方法的驗證)［1］( 通則 1033) ”內容最新且全面，該通則介紹了生物活性/效價測定方法的主要驗證參數，強調了設立系統適用性要求的重要性，通過報告驗證指標的置信區間控制實驗誤差大小，并建議耐用性應在方法開發階段進行重點考察。此外，該通則還重點介紹了驗證方案的制定、結果文件記錄、驗證設計、各驗證參數的驗證策略、驗證可接受標準、方法維護及統計學考量等內容，對于研究建立我國“生物制品生物活性/效價測定方法驗證指導原則”提供了很好的參考。
生物技術藥物的快速發展使各種新的生物活性測定方法層出不窮，建立與之配套的分析方法驗證指導原則以保障測定方法適用于檢測目的，從而科學、準確的評價或控制產品的有效性成為產業和監管部門的迫切需要。在此背景下，國家藥典委員會及時立項開展相關研究，由上海市食品藥品檢驗研究院牽頭，廣東省藥品檢驗所參與完成了《中國藥典》2020 年版新增通則《生物活性/效價測定方法驗證指導原則》( 通則 9401) 。本通則是在前期對比研究國內外各相關指南［2-19］的基礎上，通過初步調研國外具有相關經驗的制藥企業，了解各企業在開展生物活性/效價測定方法驗證時的實操情況及主要遵循的指導原則，以 ICHQ2 ( Ｒ1 )［2］為 原 則 導 向，USP ＜ 1033 ＞［1］為 內 容 藍 本，啟 動《中 國 藥 典》( ChP) 相關技術指南( 通則 9101)［20］的起草工作，隨后邀請國內 12 家企業開展了擴大驗證。最終完成的技術指南( 通則 9401) 主要用于指導和規范新建活性/效價方法或因各種相關變更涉及活性/效價測定方法的改變時的驗證工作。
1 現行國內外相關標準比較
本指導原則起草過程中綜合考慮了 ICHQ2( Ｒ1)［2］、USP ＜ 1033 ＞［1］和 ChP ＜ 通則9101 ＞［20］相關原則以及企業實操情況和最新發展趨勢，在適用范圍、框架結構及涵蓋內容方面與 USP ＜ 1033 ＞［1］相似，本指導原則提取了相關統計學術語與名詞進行專門內容解釋，而 USP ＜ 1033 ＞［1］對于相關術語和名詞將是在各具體項下說明或指向其他通則。
在內容設置上，ChP ＜ 9401 ＞ 按照方法驗證生命周期的理念，將“方法驗證的基本要素”分為驗證方案的制訂、各驗證指標的驗證策略、驗證結果的記錄和方法的監控及再驗證四個方面來有序闡述，與USP 所涵蓋的相關內容在框架和內容分布及排序上有較大區別。ICHQ2( Ｒ1)［2］及 ChP ＜ 9101 ＞［20］適用范圍及整體框架方面較 ＜9401＞ 區別較大，且均不包含驗證實例。ICHQ2( Ｒ1)［2］適用范圍更廣，包括理化分析方法及生物測定法，框架上分為第一部分: “分析方法驗證正文及術語”( 含前言、不同分析方法需驗證的指標列表、術語) 及第二部分“分析方法驗證: 方法學”( 含前言及各驗證指標的驗證策略) ; ChP ＜ 9101 ＞［20］主要針對理化分析方法，分為前言和各驗證指標的驗證策略兩大部分。本指導原則與其他相關指南具體比較詳見表 1。
2 通則主要內容解讀
2. 1 驗證方案
開展驗證工作前首先需要制訂詳細的驗證方案作為驗證時的指導與依據。驗證方案一般包括驗證設計、驗證指標與合理的可接受標準和數據分析計劃等，同時要考慮到驗證工作中可能會有失敗的情形，應在驗證方案中對不滿足可接受標準時需采取的措施加以規定。
驗證設計應重點考量檢測過程中的可能對實驗結果產生較大影響的因素，因此做驗證設計時至少需考慮要考量哪些因素，比如分析人員、細胞代次、關鍵試劑、測定板、重復策略等; 還需考慮是采取嵌套設計還是析因設計或其他合適的實驗設計模式，需要根據研究目的而定; 還有為了使驗證指標符合預設的可接受標準，需考慮進行驗證的樣本量等。驗證指標需要視具體方法擬訂。可接受標準的制定應基于決策風險最小化的原則，即應盡量降低因方法變異而對測定結果作出誤判結論的概率，根據測定方法特點和驗證目的來確定。此外，應設置試驗有效性的可接受標準即系統適用性要求以證明試驗體系運行良好和保證實驗結果的可靠性; 且由于相對效價測定屬于對比檢定，要求標準品和供試品的劑量反應曲線相似，因此還需設置樣品結果有效性的可接受標準即樣品適用性要求。
進行數據分析時，建議根據數據的實際分布情況來選擇分析方法: 對于測得相對效價呈正態分布的，數據可不經轉換直接進行處理; 對于大多數測得相對效價呈偏態分布的，需經對數轉換為呈正態性分布的數據再處理。當無法滿足上述統計學要求時，也可考慮釆用其他適宜的替代方法進行數據分析。
2. 2 各驗證指標的驗證策略
相對效價測定方法常用的驗證指標包括專屬性、準確度、精密度( 重復性、中間精密度、重現性) 、線性和范圍，后 4 個指標的驗證通常可進行合并設計。
2. 2. 1 專屬性
專屬性一般具有兩層含義: 其一，在其他雜質、降解產物及基質等存在時，采用的測定方法不受這些成分的干擾能正確測定待測物的能力; 其二，可區分相關但不同的物質。通常考察專屬性的實驗設計是平行稀釋的添加/不添加潛在干擾物的標準品同時進行試驗，或直接取基質、產品相關產物或非相關物質與待測物同時進行試驗; 另外，體現分析方法專屬性的一個重要方面就是能指示產品的穩定性，因此也可通過加速破壞待測樣品的方式來評價分析方法的專屬性是否足夠好。收載于 USP 醫藥法典( USP Medicines Compendium) 的利妥昔、曲妥珠、依那西普等單抗品種的生物活性驗證報告中，均考察了測定方法是否能指示樣品的穩定性，實驗設計主要是將樣品在不同條件下進行加速破壞，再考察方法是否能正確測定出待測物經破壞后的效價變化或與標準品劑量反應曲線的相似性是否有變化。
2. 2. 2 相對準確度
關于準確度的評價，本指導原則與 USP＜1033＞［1］類似，但與 ICH Q2( Ｒ1)［2］及ChP ＜ 9101 ＞［20］均有區別。
首先，在名稱上，ChP ＜9401＞ 和 USP ＜1033＞［1］均為“相對準確度”，而 ICH Q2 ( Ｒ1)［2］和 ChP ＜9101＞［20］均無“相 對”二 字，稱為“準確度”。其次，在定義上，ChP ＜ 9401 ＞ 和 USP ＜ 1033 ＞［1］均指測得效價與已知效價接近的程度，其中測得效價與已知效價均為相對百分數，并非效價的絕對值，而ICH Q2( Ｒ1)［2］、ChP ＜ 9101 ＞［20］將準確度均定義為測量值與真實值或參考值接近的程度，測量值與參考值一般為絕對值。最后，在評價方法和評價指標上也有區別，在評價方法上，考慮到相對準確度與線
性指標合并考察，ChP ＜ 9401 ＞ 和 USP ＜ 1033 ＞［1］均推薦評估 5 個效價水平，每個水平至少獨立測定3 次。而 ICH Q2( Ｒ1)［2］及 ChP ＜ 9101 ＞［20］建議評價同一濃度至少重復測定 6 次或至少評價 3 個濃度，每個濃度重復測定 3 次。在評價指標上，本指導原則提出可采用相對偏倚，也可采用其他適宜指標來表示，如回收率，這與 USP ＜ 1033 ＞［1］僅使用相對偏倚，而 ICH Q2( Ｒ1)［2］及 ChP ＜ 9101 ＞［20］僅使用回收率作為評價指標均有差別。這是因為相對偏倚與回收率是可以相互轉換的兩個數學概念，評價意義相同，經企業調研，回收率與相對偏倚相比，也更為大家熟知。因此，實際驗證中選用相對偏倚或回收率作為評價指標均可。
值得一提的是，在相對偏倚置信區間的報告上，考慮到目前國內企業報告該指標的普及性較低，故對其報告未作硬性要求，但仍在 ChP ＜ 9401 ＞ 中列出了相對偏倚置信區間的計算公式以作參考。目前國外標準包括 USP ＜ 1033 ＞［1］和 ICH Q2( Ｒ1)［2］對置信區間的報告均有要求。報告置信區間對評價驗證數據質量具有重要意義，目前國內外普遍做法是將獲得的驗證指標點估計值直接與其可接受標準相比，若在預設的標準范圍內，則認為結果符合要求，實際上該做法風險較大。因為每個方法都有測量誤差，而某次實驗測得的相對偏倚點估計值是否接近真值未能確定，實驗所得數據質量如何無法靠點估計值去判斷，而需要通過點估計值的置信區間來判斷實驗誤差大小是否在可接受范圍內，從而減少誤判風險。
2. 2. 3 精密度
與理化分析方法不同，相對效價測定方法通常實驗操作需要好幾天，還涉及到使用不同的檢測板，同一塊檢測板內對同一份供試品也會設置幾份獨立的重復，這樣在考察中間精密度時( 不同時間、不同檢測板、不同檢測儀器、不同操作人員、不同批號試劑等) 也涵蓋了重復性的考察。考慮到國家藥品質量標準采用的分析方法均應進行重現性驗證，故驗證指標仍涵蓋重復性、中間精密度和重現性三項，但具體的評價方法僅介紹了中間精密度的評價。
在評價指標上，鑒于使用的普及性及相對效價測定值大多數呈對數正態分布，選用幾何標準偏差( GSD) 和幾何變異系數( GCV) 代替標準差( SD) 和相對標準偏差( ＲSD) 進行評價。與相對準確度類似，本指導原則雖未對報告精密度的置信上限作硬性要求，但該指標對反映精密度數據質量的意義也不容小覷。此外，對于具備一定統計基礎的實驗室也可選用方差分析法進行精密度的評價，USP ＜1033 ＞［1］中介紹了中間精密度評價的方差分量分析法，系將中間精密度的方差分解為試驗內變異和試驗間變異，這樣可便于找出造成實驗結果變異的主要來源。但該方法對實驗人員統計學知識要求較高，推廣普及難度目前較大。
2. 2. 4 線性及范圍
與常規線性范圍考察不同，本指導原則提出了稀釋線性的概念，系根據相對準確度的實驗設計進行稀釋線性考察，評價方法可參考相對準確度。
特別要指出的是，范圍作為測定方法能達到一定準確度、精密度和線性要求時的“量的區間”，在不同分析方法中指代有所不同。在使用外標法、內標法或標曲代入法進行數據處理的理化分析方法中，該“量的區間”常指能符合要求時的劑量區間或濃度區間; 而對于使用量平行線測定法或四參數回歸計算法進行數據處理的相對效價測定法，則指稀釋線性、中間精密度和相對準確度符合要求時，可測定的效價水平劑量范圍變化的區間，即效價水平變化的區間。但兩種情況下，范圍都需覆蓋質量標準中含量或效價限度范圍。
2. 2. 5 其他驗證指標的考慮
本指導原則驗證指標未涉及耐用性。由于進行耐用性考察的目的主要是為了確定重要的實驗參數及最優范圍，以確定系統適用性要求，因而建議在測定方法開發階段或預驗證階段進行考察［1，2］，以確保驗證工作的順利進行。這與 ChP ＜ 9101 ＞［20］在方法驗證階段進行耐用性的考察有很大不同。
耐用性考察常采用全因子設計，系將待考察的因素，如細胞密度、細胞代次和藥物作用時間等設置兩個變化水平及一個中心點條件，分不同時間重復試驗，而后采用統計學方法進行數據分析，最后確定各條件的耐用范圍。
2. 3 驗證結果的記錄及方法的監控及再驗證
驗證結果應當正確、合理、規范地記錄，形成驗證報告。此外，經驗證的方法投入日常使用后，其性能是否同驗證時一樣能滿足要求需選擇合適的統計方法進行持續地監控; 并明確需要再驗證的情況，必要時可開展再驗證工作。
2. 4 方法驗證實例
生物制品有多種相對效價測定方法，目前收載于 ChP2020 最常用的方法有基于細胞和酶聯免疫吸附法( ELISA) 的體外活性測定法及基于動物的體內活性測定法。為考察本指導原則驗證要求的合理性和可行性，對不同品種進行了擴大驗證工作。為便于理解，同時增加本指導原則的可參考性，選擇擴大驗證中的體外法( 細胞法) 和體內法( 動物法) 各一例作為驗證實例來演示驗證設計、分析步驟和計算過程。以細胞法為例，驗證中將相對準確度、精密度、線性及范圍 4 個指標進行合并實驗設計，同時考察不同時間、不同分析人員和細胞代次 3 個因素對實驗結果的影響，每個因素兩個變化水平，采用三因素兩水平的全因子設計，共進行 8 輪試驗。每輪試驗中考察了在對數尺度上從 0. 5 至 2 呈均勻間隔的5 個效價水平，每個效價水平在一塊板內設置兩個獨立重復，以兩個獨立重復的平均值出具一個報告值。如此每個效價水平在 8 輪實驗中可獲得 16 個測定值，8 個報告值，最終共獲得 5 個效價水平的 80個測定值，40 個報告值。而后用該 40 個報告值合并計算來評價準確度、精密度、線性和范圍，其中準確度與線性又可通過線性回歸來合并考察。動物法考慮到實驗成本及實驗動物個體差異太大，不同效價水平的效應差異不如體外法明顯，故動物法中實驗設計及評價方式略有不同。
3 結語與展望
《中國藥典》2020 年版新增“生物制品生物活性/效價測定方法驗證指導原則”( 通則 9401) 充分借鑒了國際先進標準，引入了方法驗證生命周期的理念，在驗證中，從方案的制訂，各驗證指標的考量，驗證結果的記錄到方法的再驗證等方面，對方法驗證的全過程進行了闡述。同時也結合國內企業實際調研情況進行了部分調整，增加了實例，提高了可操作性，可作為參考性文件指導開展驗證工作。但需要說明的是，本指導原則擬訂驗證方案時沒有固定統一的模板，需根據具體品種具體方法選擇不同的實驗設計，重點考量易引起實驗結果變異的影響因素。此外，建議各單位在開展驗證工作之前，對建立的方法進行充分的耐用性研究以保證驗證工作的順利開展，而且根據分析方法的特性及用途，在產品開發階段和生產階段決定分析方法需驗證的程度。
作為《中國藥典》上次收載的適用于生物制品生物活性/效價測定方法驗證的指導原則，未來將隨著相關技術發展進一步完善，包括細化各項驗證指標可接受標準的制訂原則，探究部分驗證指標的評價方法，以及探討分析方法經驗證后如何評估再驗證的需求和確定再驗證的程度，以滿足生物藥研發和產品質控的需要，并實現與國際標準的全面接軌。
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