糖尿病的全球發病人數高達4.25億人，其日益加重的疾病負擔是一個重大的挑戰，解決該問題對患者、護理人員、醫療系統和經濟都有多方面的要求。在糖尿病患者中，7500 萬人依賴胰島素治療。這些嚴重的胰島素缺乏和胰島素抵抗亞型患者需要通過注射或輸注胰島素、生活方式干預和持續血糖監測等綜合措施嚴格控制血糖，以降低急性不良事件（高血糖和低血糖）的發生率以及心血管疾病或腎病、神經病和視網膜病變等長期并發癥的發生率。雖然當前的注射胰島素是一種廣泛使用的療法，但是依然有可能發生危及生命的低血糖事件。
來自澳大利亞悉尼大學的Nicholas J. Hunt和Victoria C. Cogger團隊利用胰島素共軛硫化銀量子點與殼聚糖/葡萄糖聚合物的涂層，開發出一種反應靈敏的口服胰島素納米制劑。這種制劑對 pH 值有反應，在酸性環境中不溶解，在中性 pH 值下，人體十二指腸外植體和秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）的吸收率增加。該制劑對葡萄糖苷酶敏感，可觸發胰島素釋放。研究發現，該制劑口服后會分布到小鼠和大鼠的肝臟，并促進血糖的劑量依賴性降低，而不會導致患有糖尿病嚙齒動物出現低血糖或體重增加。非糖尿病狒狒的血糖降低也呈劑量依賴性。在小鼠、大鼠和非人靈長類動物中未觀察到生化或血液學毒性或不良事件。該制劑顯示了口服控制血糖而不引起低血糖發作的潛力。相關工作以題為“Oral nanotherapeutic formulation of insulin with reduced episodes of hypoglycaemia”的文章發表在2024年1月2日的國際頂級期刊《Nature Nanotechnology》。
1. 創新型研究內容
口服胰島素被認為可以模擬胰島素的內源性釋放，因此為這些挑戰提供了解決方案。胰腺分泌的胰島素大部分作用于肝臟，只有一小部分可避免肝臟清除而作用于全身。同樣，在口服后，口服胰島素首先通過門靜脈循環輸送到肝臟。然而，以往的口服胰島素臨床試驗表明，口服胰島素對降低低血糖發生率的作用微乎其微。口服胰島素在長期堅持用藥和藥物可接受性方面也有一些優勢，因為胰島素注射對于兒童、老年人和新確診的胰島素依賴型 2 型糖尿病患者來說尤其具有挑戰性，會導致他們回避、猶豫或延遲胰島素治療。此外，注射胰島素在新的治療領域（如認知障礙和阿爾茨海默病）并不被認為是一種可行的治療方法，而在這些領域，注射胰島素可能具有臨床療效。此前，本研究團隊已證明硫化銀（Ag2S）量子點（QDs）具有口服生物利用度，并能提高二甲雙胍和煙酰胺單核苷酸的吸收率、口服生物利用度和肝細胞靶向性。這些藥物本來就具有口服生物利用度，但與 QDs 共軛后，藥效提高了 100-10,000 倍，并克服了與年齡相關的藥效受損問題。本研究將這一納米技術平臺與 pH 值和酶敏感性封裝聚合物結合應用于胰島素。
【納米載體對 pH 值敏感】
胰島素口服給藥最初面臨的挑戰是其在低 pH 值下的高溶解度和降解。本研究發現與單獨使用胰島素或 QDs 相比，將胰島素附著在 Ag2S QDs 上可降低 QD 胰島素（QD-INS）在低 pH 環境中的溶解度。利用 N-（3-二甲基氨基丙基）-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）化學交聯法，將可溶性胰島素（pH 值為 3）結合到用 3-巰基丙酸（3-MPA）封端的 Ag2S QDs [直徑為 6.5 ± 1.2 nm（通過透射電子顯微鏡（TEM）測量）]表面（圖 1a）。胰島素的附著是在 pH 值為 9 的條件下進行的，生成的是可溶的 QD-INS 溶液。透析后，可溶性 QD-INS 溶液的 pH 值為 7。傅立葉變換紅外光譜（FTIR）顯示，在透析過程中去除游離胰島素后，QD-INS 具有與單獨胰島素相似的峰值，表明其附著。CS/GS 的化學結構是通過一維 1H 和二維 [1H,1H] 核奧弗霍塞爾效應光譜（NOESY）、核磁共振和傅立葉變換紅外光譜確定的（圖 1b）。在傅立葉變換紅外光譜中，β-1,4 糖苷鍵非常突出，這是因為使用了脫乙酰化殼聚糖（葡糖胺單體），它們通過這些 β-1,4 糖苷鍵聚合。葡萄糖單體在形成糖原或淀粉時通常會形成 α-1,4 或 α-1,6 糖苷鍵；但在長鏈中，它們也可以形成 β-1,4 糖苷鍵，從而形成纖維素。CS/GS 似乎同時含有 α 和 β 糖苷鍵，因此在設計時就考慮到了這種降解形式，其分解會導致胰島素的釋放。
在 pH 值為 7 時，由于 QD-INS 的負ζ電位和 CS/GS 的正ζ電位，QD-INS 和陽離子共聚物通過靜電吸引將 CS/GS 包覆在 QD-INS 上。在 α 和 β 鏈的 C 端，特別是 B21、25-27 和 30，可能促進了氫鍵的形成（圖 1b）。將這些溶液混合后，形成了 20.0 ± 1.7 nm 的 CS/GS 納米粒子，在 TEM 下可觀察到其中同時含有 Ag2S QDs 和胰島素（圖 1c）。添加 CS/GS 增加了 QD-INS-CS/GS 的動態光散射測量的流體動力（HD）直徑，而ζ電位的變化可以忽略不計（圖 1d）。在具有 -OH 功能基團和胺基團的 QD-INS-CS/GS 的傅立葉變換紅外光譜和核磁共振光譜中，CS/GS 涂層消除了胰島素的指紋標記。將 QD-INS-CS/GS 在 37 ℃ 的 pH 值為 3 的溶液中培養以促進聚合物降解，這種效應是可逆的。不同濃度的胰島素在 QDs 上的負載能力表明，胰島素的最大保留率為 80%，根據摩爾比，每個 QD 上有 1-2 個胰島素分子（圖 1e）。
圖1 口服胰島素（QD-INS-CS/GS）的配制和表征
【胰島素的釋放是由 CS/GS 的酶裂解介導的】
為了檢查胰島素有效載荷的釋放情況，本研究在肝細胞培養物中與各種水解酶、低 pH 值和溫度共孵育，測量了 QD-INS-CS/GS 的碳 14 (14C) 胰島素 (14C-INS) 釋放情況。與纖維素酶或β-葡萄糖苷酶共孵育明顯提高了釋放速度，在單室中 0.5 小時內釋放了 50%（圖 2a）。隨后，本研究使用了一個由 10 kDa 透析管隔開的雙室系統，只允許在第二個室中檢測游離的（非 QD 連接的）胰島素。與纖維素酶或β-葡萄糖苷酶共孵育會導致胰島素在 1 小時內釋放 50%（圖 2b）。釋放率隨溫度和 pH 值的降低而增加（圖 2b），這表明 CS/GS 對酶降解，尤其是對β-葡萄糖苷酶的降解非常敏感。通過質譜分析，釋放的胰島素主要是單體（87.5%），少量存在二聚體（11.5%）和三聚體（<1.0%）（圖 2c）。在 QD-INS 和 QD-INS-CS/GS 與單獨的胰島素之間觀察到了類似的光譜峰（圖 2c）。
本研究還在肝細胞培養物中評估了胰島素和蔗糖的吸收。當與 QDs 共軛時，14C-INS 的攝取量增加了一倍，而與 QD-INS-CS/GS 共軛的制劑則逆轉了這種效應（圖 2d），這表明 CS/GS 與受體激活關鍵的 β 鏈 C 末端發生了相互作用。用 QD-INS-CS/GS 或 QD-INS-CS/GS 釋放的胰島素預處理肝細胞，突出表明 CS/GS 必須在胰島素作用前降解，并顯示 QD-INS 具有生理活性（圖 2e）。
圖2 QD-INS-CS/GS 的胰島素釋放量
【納米載體提高人體腸道外植體的吸收率】
本研究使用人十二指腸外植體研究了腸道攝取情況，這與本研究團隊之前在小鼠體內的研究類似。人十二指腸外植體細胞攝取的實時成像（圖 3a）顯示，2-4 分鐘內的活體攝取主要集中在細胞質中（70%）（圖 3b）。8 分鐘后觀察到內泡形成和外排。用 QD-INS-CS/GS 配制后，人十二指腸外植體對 14C-INS 的吸收率提高了 40 倍（圖 3c）。
【胰島素納米載體促進秀麗隱桿線蟲的脂肪儲存】
本研究還在秀麗隱桿線蟲（C. elegans）中對腸道吸收進行了驗證。由于其腸道屏障和對胰島素的生理反應，該模型可用于口服給藥納米技術的初步篩選。過量的胰島素會抑制體內儲存脂肪的釋放和能量利用，促進脂肪儲存。本研究觀察到，與對照組相比，20 µg ml-1 QD-INS-CS/GS 與 OP50 大腸桿菌（大腸桿菌）以 1:1 的比例混合 24 小時的高劑量會增加前部脂肪儲存（圖 3d,e）。
圖3 十二指腸外植體對 QD-INS(488)-CS/GS 的吸收率
【納米載體提高了小鼠的生物利用度和療效】
使用 14C-INS 評估了皮下注射胰島素（SC-INS）和口服 QD-INS-CS/GS （20 IU kg-1）的生物分布。在 C57BL/6J 小鼠體內，QD-INS-CS/GS 的 Cmax 值為 0.06 IU ml-1，Tmax 值為 0.5 小時，T½ 值為 0.5 小時；相比之下，SC-INS（2 IU kg-1）的 Cmax 值為 0.1 IU ml-1，Tmax 值為 0.25 小時，T½ 值為 0.25 小時。根據血藥濃度計算，口服 QD-INS-CS/GS 的生物利用度為 4%（圖 4a）。
本研究還關注了 SC-INS、QD-INS-CS/GS 和不含納米技術的口服胰島素（Oral-INS）在全血、肝臟、肌肉、脂肪、十二指腸、腎臟和脾臟中的分布情況。0.5 小時后，SC-INS 在血液、肝臟和肌肉/脂肪中的分布比例分別為 40%、40% 和 20%（圖 4b）。相比之下，QD-INS-CS/GS 在肝臟的分布比例為 20%，在腸道的分布比例為 60%（圖 4c）。2 小時后，SC-INS 和 QD-INS-CS/GS 在肝臟、小腸和腎臟的分布比例分別為 50%、20% 和 10%。SC-INS在肌肉和脂肪中的分布更多，而QD-INS-CS/GS則只針對肝臟。口服-INS 仍留在小腸中。
通過口服葡萄糖耐量試驗（oGTT）和口服葡萄糖前 15 分鐘用 SC-INS 和口服 QD-INS-CS/GS 進行預處理，本研究關注了 C57BL/6J 小鼠的藥效學效應。SC-INS（2 IU kg-1）和口服 QD-INS-CS/GS（20 IU kg-1）對 oGTT 曲線下面積（AUC）的降低作用相似（圖 4d）。注射和口服胰島素都出現了劑量依賴性效應（圖 4b）。高劑量（5 IU kg-1）SC-INS 會引起低血糖（血糖 < 3.0 mmol l-1），而口服胰島素即使在 300 IU kg-1 的劑量下也不會引起低血糖（圖 4e）。QD-INS-CS/GS 的單個成分（QD，0.6 µg；胰島素，20 IU kg-1；CS/GS，10 µg）也通過 oGTT 進行了檢測。沒有觀察到單個材料或單獨口服胰島素（100 IU kg-1）對 AUC 有任何影響。
圖4 單劑量 SC-INS、QD-INS-CS/GS 和單獨口服胰島素的藥代動力學和藥效學研究
【胰島素納米載體在 T1D 動物模型中發揮療效】
本研究在以下 T1D 動物模型中比較了 SC-INS 和 QD-INS-CS/GS 單劑量和/或慢性治療的藥理作用：非肥胖糖尿病（NOD）小鼠（自身免疫誘導的 T1D）和接受鏈脲佐菌素（STZ）（單劑量 65 mg kg-1）治療的大鼠（毒素誘導的 T1D）。在 NOD 小鼠中，SC-INS（1 IU kg-1）和 QD-INS-CS/GS（25 IU kg-1）都能在 15 分鐘內降低血糖，并使 ITT AUC 降低 40%（圖 5a）。隨著劑量的增加，這兩種藥物的血糖降低也呈現劑量依賴性（圖 5b）。慢性 2 周 SC-INS 給藥或在飲用水中自由給藥 QD-INS-CS/GS 表明，QD-INS-CS/GS 可在治療期間維持血糖小于 11.1 mmol l-1。這種效應在 7 天的沖洗期后逆轉（圖 5c）。經 SC-INS 治療的小鼠在治療后 1 小時血糖下降，隨后在治療后 8 小時恢復到基線水平。在重度糖尿病 STZ 大鼠（血糖 > 30 mmol l-1）中，注射胰島素和口服胰島素對血糖的降低具有相似的劑量依賴性（圖 5d）。慢性用藥是通過使用 SC-INS 或在飲用水中自由給藥 QD-INS-CS/GS 進行為期 2 周的治療。在治療期間，QD-INS-CS/GS 可將血糖維持在 15-25 mmol l-1 的較低水平，而在 3 天的沖洗期后，這種效應消失（圖 5e）。持續 6 周的治療表明，SC-INS 大鼠的體重增加了 30%，而接受 QD-INS-CS/GS 治療的小鼠體重沒有變化（圖 5f）。這些大鼠的血清生化或血脂也沒有變化。
圖5 在 NOD 小鼠和 STZ 治療大鼠中使用 SC-INS 和 QD-INS-CS/GS（口服胰島素）進行單劑量和 2 周每日治療的藥效學研究
【胰島素納米載體在非人靈長類動物中發揮療效】
為了檢驗 QD-INS-CS/GS 在臨床應用中的有效性和準備情況，本研究對來自美國國家狒狒群落的非糖尿病狒狒進行了研究，BG 和毒性數據收集工作均獨立進行。每只狒狒都在一夜禁食后進行了 ITT；在基線和口服 1-10 IU kg-1 胰島素后收集數據（圖 6a）。使用 5 和 10 IU kg-1 的 QD-INS-CS/GS 治療可使血糖分別下降 10% 和 13%，在 15-30 分鐘內即可觀察到效果（圖 6a）。即使在初始血糖為 2.9 mmol l-1 的狒狒子群中，單次劑量為 5 IU kg-1 的 QD-INS-CS/GS 也不會導致任何狒狒出現低血糖。對血糖為 4.9 mmol l-1 的狒狒施用相同劑量可使血糖降低 10%（圖 6c）。試驗后進行的血液生化、血脂和血液學評估顯示，沒有超出參考范圍的變化。此外，未報告任何不良事件，包括任何低血糖發作。
圖6 非糖尿病狒狒的 ITT
2. 總結與展望
總之，胰島素與帶有 CS/GS 聚合物涂層的 Ag2S QDs 共軛過程在 CSIRO 的生產過程簡單且具有可重復性。該產品促進了胰島素的口服吸收和肝臟靶向性。在小鼠、大鼠和狒狒身上，該產品顯示出劑量依賴性效應，低血糖發生率降低，且無毒性。這些研究為在人體中評估這種制劑、正在進行的毒性和臨床研究奠定了基礎。這項技術旨在成為口服多肽給藥的平臺。它適用于作用于肝臟（如干擾素-α）或其他器官（如胰腺的胰高血糖素樣肽-1 促效劑（利拉魯肽））的多肽和蛋白質。
文章來源：https://www.nature.com/articles/s41565-023-01565-2
