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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2024-08-23 08:37
活性氧（ROS）是氧代謝的天然副產(chǎn)物，正常情況下，機(jī)體含量較低。當(dāng)機(jī)體受到損傷刺激時(shí)，如藥物毒性、缺氧等，ROS水平會(huì)急劇增加，超過(guò)機(jī)體自身清除能力時(shí)，機(jī)體氧化-抗氧化作用失去平衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，最終引起機(jī)體細(xì)胞死亡。因此，ROS的測(cè)定有助于判斷細(xì)胞損傷情況。
基本原理：目前檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平常用的是DCFH-DA熒光探針?lè)?。DCFH-DA可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，本身沒(méi)有熒光。細(xì)胞內(nèi)的酯酶可將DCFH-DA水解生成不能通過(guò)細(xì)胞膜的DCFH，這樣使得探針在細(xì)胞內(nèi)形成積聚。經(jīng)過(guò)經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS的氧化，DCFH可轉(zhuǎn)變?yōu)橛袩晒獾腄CF，且熒光的強(qiáng)度與ROS的水平成正比。
一、實(shí)驗(yàn)流程
以下是流式細(xì)胞儀檢測(cè)貼壁細(xì)胞ROS的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、準(zhǔn)備細(xì)胞：將目的細(xì)胞均勻鋪至六孔板中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別做相應(yīng)處理，并預(yù)設(shè)空白管（即不裝載探針）。至細(xì)胞密度達(dá)到80%-95%。
2、清洗：用PBS將六孔板中細(xì)胞分別清洗1-2次，并棄去PBS。
3、消化：用胰酶將六孔板中細(xì)胞消下來(lái)，移至1.5mlEP管中，并做好標(biāo)記。
4、離心：1200r，常溫，離心5min。
5、探針配制：按照2μl DCFH-DA原液：3ml無(wú)血清培養(yǎng)基配制，上下顛倒混勻（注意避光）。
6、加入探針：棄去4中培養(yǎng)基，空白管加入1ml無(wú)血清培養(yǎng)基，其余均加入1ml配制好的探針液，并重懸細(xì)胞（注意避光）。
7、孵育：37°C避光孵育20min。
8、離心：1200r，常溫，離心5min，棄去上清。
9、清洗：用1ml冷PBS清洗，1200r，常溫，離心5min，棄去上清，重復(fù)2次（注意避光）。
10、上機(jī)：將細(xì)胞用500μl冷PBS重懸，并移至流式管，上機(jī)。
注意事項(xiàng)：
1、消化細(xì)胞時(shí)，以細(xì)胞剛好掉落為好，不可時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，避免過(guò)度消化造成細(xì)胞損傷而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
2、探針配置時(shí)，一般按照1：1000用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA（終濃度為10Μm），不同的細(xì)胞系條件有所不同，需自行摸索。
3、加入探針后，一定要充分混懸細(xì)胞，以保證探針完全結(jié)合。
4、探針?lè)跤龝r(shí)，每隔3-5min需顛倒混勻。
5、探針?lè)跤龝r(shí)間不同細(xì)胞可能會(huì)不一樣，一般為20-30min。
6、最佳激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，最佳發(fā)射波長(zhǎng)為525nm。
二、結(jié)果分析
FlowJo 是一款流式細(xì)胞數(shù)據(jù)分析軟件，通過(guò)圖像分析細(xì)胞的各種變化，利用自帶的分析功能，導(dǎo)出可以二次編輯的圖形。它可以支持多種格式，并且可以做出質(zhì)量不錯(cuò)的圖。接下來(lái)介紹如何對(duì)活性氧（ROS）的流式-單染數(shù)據(jù)分析。
1、導(dǎo)入流式數(shù)據(jù)（以fcs格式為例）：
將要導(dǎo)入的文件（一個(gè)或多個(gè)）拖入All Samples中。
圖 1
2、設(shè)置橫縱坐標(biāo)：
根據(jù)以下箭頭所示位置，將橫軸設(shè)置為FSC-A：：FSC-A，縱軸設(shè)為SSC-A：：SSC-A。
圖 2
3、調(diào)整細(xì)胞群：
分別調(diào)整以下箭頭所示位置，將絕大部分目的細(xì)胞調(diào)整至視野中。
圖 3
選擇Customize Axis，將細(xì)胞群調(diào)整至中間位置，點(diǎn)擊Apply，橫縱軸操作一樣。
圖 4
4、圈出主要細(xì)胞群：
點(diǎn)擊下圖所示位置，點(diǎn)擊設(shè)門(mén)工具，選取目標(biāo)細(xì)胞。
圖 5
圈出大多數(shù)細(xì)胞至90%以上。彈出對(duì)話框輸入細(xì)胞名稱(chēng)，點(diǎn)擊OK。
圖 6
5、調(diào)整橫縱坐標(biāo)：
雙擊圈出的細(xì)胞群，就可以直觀看到所圈出的細(xì)胞群。
圖 7
參考步驟2將橫軸改為FL4-A：：APC-A，縱軸更換為Histogram，即X軸選擇熒光通道，Y軸選擇直方圖。
圖 8
6、將門(mén)應(yīng)用到所有細(xì)胞：拖動(dòng)圖8所示的門(mén)至上方的All Samples中，即可看到這個(gè)門(mén)應(yīng)用到了所有細(xì)胞，（如果需要單獨(dú)應(yīng)用，則拖到相應(yīng)的細(xì)胞即可。）雙擊任意一個(gè)門(mén)，即可看到剛才的直方圖。點(diǎn)擊上方的左右箭頭可以查看其他的樣本。
圖 9
7、繪制圖形
點(diǎn)擊上方的Layout Editor，出現(xiàn)右側(cè)涂層框。
圖 10
將一個(gè)門(mén)拖入涂層窗口中，這樣會(huì)自動(dòng)做一張信息圖。
圖 11
將其他的樣本依次拖入這個(gè)直方圖中（如果拖動(dòng)到頁(yè)面中就再單獨(dú)添加一張圖），就得到一張疊加圖。
圖 12
點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，在Histograms中可以選擇直方圖的疊加方式，比較常見(jiàn)的為Offset。
圖 13
雙擊流式圖，在Specity窗口中點(diǎn)擊Smoothing對(duì)曲線進(jìn)行平滑，會(huì)好看很多。
圖 14
通常我們不需要右側(cè)的表格，選中按下Delete進(jìn)行刪除，至此就得到了一張基本可以發(fā)表的流式圖。
圖 15
8、導(dǎo)出編輯：
在Layout的File菜單中，點(diǎn)擊Export Image。如果使用AI，選擇SVG格式；如果使用CorelDraw，使用EMF格式。
圖 16
參考資料：
https://images.app.goo.gl/SAR9CiAzR4xBoCZr8
Arfin S, Jha NK, Jha SK, et al. Oxidative Stress in Cancer Cell Metabolism. Antioxidants (Basel). 2021;10(5):642. Published 2021 Apr 22.
Rajneesh, Pathak J, Chatterjee A, et al. Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cyanobacteria Using the Oxidant-sensing Probe 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate (DCFH-DA). Bio Protoc. 2017;7(17):e2545. Published 2017 Sep 5.
來(lái)源：實(shí)驗(yàn)老司機(jī)
