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qPCR技術重復的副孔是為了避免操作失誤帶來的數據錯誤。理論上，如果每一次操作都完全一致，那么CT值的差異理論上會為0，但實際操作中幾乎不可能，所以我們追求的是CT值的差異越小越好。那差異應該在什么范圍內才屬于可以接受的結果呢？

一般情況下，一個樣本會設置三個復孔，最終該樣本會得到3個CT值。此時，使用excel表格內的公式：STDEV(x1,x2,x3)，就可以獲得這三個CT值的標準差，也就是SD值，SD小于0.5，則認為是可以接受的實驗操作結果。SD越小，代表三個數值之間的差異越小，如果三個數值都一樣，那它們的SD值就為0。

此外，復孔CT值的差異大小，除了和操作因素有關，還受其他因素影響。這里，我們挑2個來講：

1 孔間反應的差異。如果使用一些比較老舊的設備進行反應，而復孔剛好落在加熱板的邊緣位置，那么邊緣的孔的反應效率就會和非邊緣孔的不一致，進而造成最終的CT值差異。因此，應該盡量避開這種位置進行反應。

2 樣本質量較差。例如，如果樣本cDNA濃度不夠高，跑出來的CT值會較大，當CT大于30之后，復孔的SD值會開始變得更大，而理想的CT值范圍是25-30之間。