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摘要

目的   通過(guò)考察與腮腺炎病毒原液直接接觸的一次性儲(chǔ)液袋在凍存情況下的浸出物水平，評(píng)估使用一次性儲(chǔ)液袋凍存腮腺炎病毒原液的安全性。

方法   將使用一次性儲(chǔ)液袋和標(biāo)準(zhǔn)肖特瓶盛裝的腮腺炎病毒模擬料液放置于-60 ℃以下冰箱保存，分別于0、6、12、15個(gè)月各取出3份樣品，以提取物研究中檢出的丙酮、叔丁醇和異丙醇作為靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行浸出物檢測(cè)及安全劑量分析。

結(jié)果   丙酮、叔丁醇和異丙醇在保存周期中均于15個(gè)月時(shí)出現(xiàn)檢出最高峰，浸出物含量分別達(dá)到415.02、275.82和936.92 μg/L，且各檢測(cè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)一次性儲(chǔ)液袋浸出物含量均低于允許日接觸量或安全評(píng)估閾值。

結(jié)論   使用一次性儲(chǔ)液袋凍存的腮腺炎病毒模擬料液的浸出物含量未超出安全范圍，安全性風(fēng)險(xiǎn)小。

腮腺炎病毒屬于副黏病毒科，為單股RNA病毒，不耐酸且易被脂溶劑滅活。國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)的腮腺炎病毒疫苗原液制備工藝采用原代雞胚細(xì)胞，經(jīng)由細(xì)胞培養(yǎng)、病毒接種及收獲病毒液合并制得。腮腺炎病毒對(duì)熱敏感，極不穩(wěn)定，目前國(guó)內(nèi)主要采用玻璃瓶?jī)龃嫒傺撞《驹阂越鉀Q上述問(wèn)題，但玻璃瓶存在密閉性差、空間占用大、轉(zhuǎn)運(yùn)不便且融化過(guò)程破損嚴(yán)重等弊端。

一次性聚乙烯儲(chǔ)液袋是目前生物行業(yè)廣泛應(yīng)用于盛裝液體的容器，近幾年開(kāi)始被用于疫苗原液凍存，該品可以有效解決玻璃瓶使用過(guò)程中的諸多不便。作為直接接觸藥品的容器，一次性儲(chǔ)液袋對(duì)藥品安全性、有效性及穩(wěn)定性的影響受到藥品行業(yè)及藥監(jiān)部門的關(guān)注。

腮腺炎病毒原液需要長(zhǎng)期低溫保存于容器中，浸出物有可能隨時(shí)間逐漸增加。本研究將在容器容量、表面積和儲(chǔ)液量符合實(shí)際的前提下，通過(guò)分時(shí)檢測(cè)腮腺炎病毒模擬料液的相關(guān)浸出物，評(píng)估一次性儲(chǔ)液袋儲(chǔ)存腮腺炎病毒原液時(shí)的浸出物含量，驗(yàn)證其安全性和實(shí)用性。

1、材料與方法

1.1主要試劑

199培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，碳酸氫鈉（分析純級(jí)）和人血白蛋白（藥品）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

丙酮、叔丁醇、異丙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液購(gòu)自美國(guó)Accustandard公司，10 mg/ml水溶液。內(nèi)標(biāo)物：氘代乙醇-d6（CAS：1516-08-1）購(gòu)自比利時(shí)Acros Organics公司。

1.2儀器與設(shè)備

25 ml肖特試劑瓶和50 ml一次性儲(chǔ)液袋、用于保存樣品的超低溫冰箱（可設(shè)置至-60 ℃以下并穩(wěn)定運(yùn)行）均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司（賽默飛）。Shimadzu QP2010ultra型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀由清華大學(xué)分析中心提供，配備有TR-WAXMS GC色譜柱（購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，30 m×0.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣口250 ℃，載體為高純氦氣，流量為1 ml/min，分流比為10。升溫程序：35 ℃保持4 min。離子源200 ℃，接口250 ℃。

1.3樣品盛裝容器

1.3.1　空白組　采用25 ml肖特試劑瓶盛裝。該肖特試劑瓶的耐化學(xué)性符合ISO3585和4796標(biāo)準(zhǔn)，目前尚無(wú)此類容器存在丙酮、叔丁醇和異丙醇溶出或潛在溶出物的報(bào)道。

1.3.2　試驗(yàn)組　采用50 ml一次性儲(chǔ)液袋。該規(guī)格一次性儲(chǔ)液袋與生產(chǎn)使用的20 L大容量?jī)?chǔ)液袋所采用的材質(zhì)均為聚乙烯CX5-14膜。

1.4樣品準(zhǔn)備

1.4.1　各容器比表面積對(duì)比　由表1可見(jiàn)，50 ml儲(chǔ)液袋的比表面積最大，為12.82 cm2/ml，處于最具有挑戰(zhàn)性的試驗(yàn)環(huán)境中，而實(shí)際生產(chǎn)中使用的20 L儲(chǔ)液袋的比表面積為0.70 cm2/ml，僅為50 ml儲(chǔ)液袋比表面積的約1/18。將50 ml儲(chǔ)液袋作為浸出物試驗(yàn)的樣品袋，得出的試驗(yàn)結(jié)論最具有代表性和權(quán)威性，對(duì)于判定實(shí)際生產(chǎn)的安全性更可靠。

1.4.2　模擬料液配制與裝載　模擬料液含注射用水、199培養(yǎng)基、人血白蛋白、碳酸氫鈉，為腮腺炎病毒原液的最終培養(yǎng)液體系，與生產(chǎn)用原液配液比一致，除不含腮腺炎病毒外所有成分組成無(wú)任何差異；并通過(guò)加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至與實(shí)際腮腺炎病毒原液一致。空白組于25 ml肖特試劑瓶中裝入25 ml模擬料液，試驗(yàn)組于50 ml一次性儲(chǔ)液袋中裝入25 ml模擬料液。

1.4.3　浸出物樣品準(zhǔn)備及送檢　空白組和試驗(yàn)組均放入-60 ℃以下冰箱凍存，分別于0、6、12和15個(gè)月各取出3份送樣檢測(cè)。樣品運(yùn)輸方式采用干冰運(yùn)輸，保證運(yùn)輸過(guò)程中樣品無(wú)解凍。檢測(cè)前將樣品容器置于水浴解凍（水溫30 ℃以下），待樣品完全解凍后，輕柔搖晃使料液完全混勻。委托賽默飛聯(lián)合北京清華大學(xué)分析中心進(jìn)行丙酮、叔丁醇和異丙醇含量檢測(cè)，每份樣品檢測(cè)1次。浸出值的計(jì)算方式為將試驗(yàn)組檢測(cè)均值減去空白組檢測(cè)均值，以去除樣本中本來(lái)含有的物質(zhì)的影響，如差值為負(fù)數(shù)可認(rèn)為試驗(yàn)組對(duì)照于空白組無(wú)浸出，相對(duì)浸出數(shù)值計(jì)為0。

1.5浸出物檢測(cè)及安全劑量分析

1.5.1　浸出物檢測(cè)　使用GC-MS儀對(duì)送檢的空白組和試驗(yàn)組樣品中的丙酮、叔丁醇和異丙醇進(jìn)行含量檢測(cè)，檢測(cè)中的儀器精度和準(zhǔn)確度達(dá)到分析痕量揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)要求。

1.5.2　安全劑量分析　根據(jù)ICH Q3C（R8）《雜質(zhì)：殘留溶劑的指導(dǎo)原則》中常用有機(jī)溶劑分類及殘留限度的要求進(jìn)行殘留毒性分析，評(píng)估相關(guān)浸出物的安全劑量。

2、結(jié)果

2.1浸出物試驗(yàn)結(jié)果

由表2可見(jiàn)，到部分節(jié)點(diǎn)后數(shù)據(jù)呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，而浸出值的負(fù)增長(zhǎng)并不一定是一次性儲(chǔ)液袋中浸出物含量的減少。測(cè)試樣品在0—15個(gè)月的保存周期中（該測(cè)試周期已覆蓋腮腺炎病毒原液12個(gè)月的保存周期），丙酮、叔丁醇和異丙醇均于15個(gè)月時(shí)出現(xiàn)檢出最高峰，浸出物含量分別達(dá)到415.02、275.82和936.92 μg/L，可以判斷在整個(gè)保存周期中丙酮、叔丁醇和異丙醇的浸出物含量呈現(xiàn)波動(dòng)增加的趨勢(shì)，雖然在中間部分檢測(cè)節(jié)點(diǎn)出現(xiàn)了未增長(zhǎng)的情況，但在保存至15個(gè)月的最終檢測(cè)節(jié)點(diǎn)時(shí)，丙酮、叔丁醇和異丙醇的浸出值與0個(gè)月的浸出值相比均大幅增長(zhǎng)。從整個(gè)保存周期和檢測(cè)周期判斷丙酮、叔丁醇和異丙醇3種物質(zhì)的浸出值是有所上升的（見(jiàn)表2）。

2.2浸出物安全劑量分析

根據(jù)ICH Q3C（R8）《雜質(zhì)：殘留溶劑的指導(dǎo)原則》，丙酮和異丙醇均為3類溶劑，叔丁醇為2類溶劑。殘留的3類溶劑含量依照原則需低于0.5%，0.5%的溶劑含量相當(dāng)于5 000 μg/L，而該數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本試驗(yàn)各時(shí)間節(jié)點(diǎn)中檢測(cè)出的3類溶劑的最大測(cè)試濃度（非均值）721.51、321.00、2 040.35 μg/L。因叔丁醇為2類溶劑，故在此基礎(chǔ)上以更能反映藥物安全性的允許日接觸量（permitted daily exposure，PDE）來(lái)進(jìn)行評(píng)估，并以終產(chǎn)品中樣品的每日最大注射量為0.5 ml計(jì)算最大攝入量。

本次試驗(yàn)中PDE按照較嚴(yán)格的靜脈注射藥品的要求進(jìn)行計(jì)算，數(shù)據(jù)來(lái)源于化學(xué)物質(zhì)毒性數(shù)據(jù)庫(kù)。由表3可知，試驗(yàn)中檢出的3種浸出物成分的最大攝入量均低于相應(yīng)的PDE。實(shí)際使用中，相關(guān)疫苗產(chǎn)品是由病毒原液經(jīng)稀釋配制而成，這意味著即使在更嚴(yán)格的情況下，各浸出物的最大攝入量都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PDE的限值。使用一次性儲(chǔ)液袋并不會(huì)有安全性隱患。

3、討論

一次性儲(chǔ)液袋與藥品應(yīng)具有良好的相容性，本研究遵循《化學(xué)藥品注射劑與塑料包裝材料相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》開(kāi)展部分相容性研究，相關(guān)研究均符合國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)。

檢測(cè)中方法的檢測(cè)靈敏度為μg/L，定量方法采用選擇性離子監(jiān)測(cè)方法定量，定量離子分別為丙酮（43）、叔丁醇（59）、異丙醇（45）、氘代乙醇（33），3種待測(cè)物的線性范圍為質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2~100）×10-8。采用內(nèi)標(biāo)法定量，氘代乙醇為質(zhì)量分?jǐn)?shù)5×10-7。另外，氘代乙醇和異丙醇的保留時(shí)間相近（在質(zhì)譜圖上峰重合），不過(guò)定量離子不同且非相互的特征離子，不影響定量。由于試驗(yàn)中使用的GC-MS儀定量限為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2×10-7，為較小的數(shù)值，因此相較于數(shù)值較大的數(shù)據(jù)，本次試驗(yàn)中的檢出數(shù)據(jù)的浮動(dòng)性相對(duì)較大。數(shù)值級(jí)別較小，更加證明了浸出物含量的數(shù)量級(jí)遠(yuǎn)未達(dá)到可以造成不良影響的程度。

由于丙酮、叔丁醇和異丙醇作為提取研究中確定的研究成分，均存在吸附和蒸發(fā)作用的影響，因此檢測(cè)周期中浸出物檢出的數(shù)值未必一定會(huì)隨著保存時(shí)間增加而增加，本次試驗(yàn)組的一次性儲(chǔ)液袋為加蓋密閉容器并在蓋子處纏繞絕緣膠帶進(jìn)行密閉保護(hù)，在進(jìn)行檢測(cè)前不進(jìn)行任何拆卸外包的動(dòng)作，檢測(cè)過(guò)程中也進(jìn)行樣品的搖勻，最大程度避免了吸附和蒸發(fā)作用對(duì)本次試驗(yàn)的容器影響，檢測(cè)數(shù)據(jù)可信度高。

本次試驗(yàn)中，丙酮、叔丁醇、異丙醇3種檢出成分按產(chǎn)品每日最大注射量0.5 ml進(jìn)行計(jì)算，檢測(cè)值均低于歐洲藥監(jiān)局推薦的1.5 μg/d的安全性閾值。同時(shí)通過(guò)USP<88>動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)也確定了溶出物在大劑量注射方面的安全性。

上海生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗二室在進(jìn)行儲(chǔ)液袋相容性試驗(yàn)的同期也進(jìn)行了實(shí)際儲(chǔ)存原液及原液配制成品的相關(guān)性研究，穩(wěn)定性研究顯示使用一次性儲(chǔ)液袋凍存腮腺炎病毒原液在規(guī)定的有效期內(nèi)可確保符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，甚至原液保存至超效期后仍符合腮腺炎病毒原液的滴度標(biāo)準(zhǔn)，與使用原1 L玻璃瓶無(wú)明顯差異，利用上述超效期原液配制的麻腮風(fēng)聯(lián)合減毒活疫苗成品在超保存效期的各項(xiàng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的檢測(cè)項(xiàng)目均符合企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。即一次性儲(chǔ)液袋對(duì)于保存腮腺炎病毒原液在安全性、有效性及穩(wěn)定性方面均有很好的保障，可以替代1 L玻璃瓶作為腮腺炎病毒原液的保存容器進(jìn)行最多12個(gè)月的凍存。

另外，提升單個(gè)容器的凍存裝量可保證產(chǎn)品質(zhì)量更加穩(wěn)定均一，縮短制凍時(shí)間可減少病毒滴度的損耗，相較于傳統(tǒng)1 L玻璃瓶的手工制凍方式，儲(chǔ)液袋的機(jī)器制凍方式可減少對(duì)終產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生的不利影響，這也成為一次性儲(chǔ)液袋替代1 L玻璃瓶作為腮腺炎病毒原液保存容器的一大優(yōu)勢(shì)。

引用本文：陳曉望, 楊文震, 周鋒, 等. 一次性儲(chǔ)液袋凍存腮腺炎病毒原液的浸出物研究 [J]. 國(guó)際生物制品學(xué)雜志, 2024, 47(5): 281-284.