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嘉峪檢測網 2025-01-09 09:05
摘要
相比化學仿制藥，化學創新藥由于其結構新穎，降解途徑未知等特點，在強制降解研究的主要降解產物歸屬，降解試驗條件摸索，降解產物的致突變性研究等方面需更多嘗試。目前，已有多篇針對藥物強制降解研究的文獻綜述，但未對化學創新藥的強制降解研究進行針對性的論述。本文參考國內外相關文獻，并結合在藥物研發中的實踐，重點對化學創新藥強制降解研究的主要降解產物歸屬，降解試驗條件摸索及降解產物的致突變性等內容進行討論，以期為藥物研發人員提供一些借鑒。
關鍵詞：化學創新藥；強制降解；一般考慮；降解試驗條件；降解產物；致突變性
化學藥物的強制降解研究在藥物研發過程中扮演著十分重要的角色，其具體作用可能包括但不限于：（1）有助于確定分子的內在穩定性，鑒定藥物可能的降解產物，確定降解路線揭示降解機理；（２）驗證所用的分析方法對藥物穩定性的指示能力；（３）指導藥品處方工藝和包裝系統的開發，確定藥品貯藏條件；（４）對藥物的安全性和毒性進行評估；（５）指導藥物的鹽基和晶型的選擇；另外，強制降解試驗會產生藥物的代謝產物，有助于加強對藥物吸收、分布、代謝與排泄的理解［１］。
目前，已有多篇針對藥物強制降解研究的文獻綜述［2-7］，但未對化學創新藥的強制降解研究進行針對性的論述。相比化學仿制藥，化學創新藥由于其結構新穎、降解途徑未知等特點，在強制降解研究的主要降解產物歸屬、降解試驗條件摸索、降解產物的致突變性研究等方面需更多嘗試。本文參考國內外相關文獻，并結合在藥物研發中的實踐，針對化學創新藥強制降解研究進行討論，以期為藥物研發人員提供一些借鑒。
1、創新藥降解反應條件的選擇
藥物的強制降解研究通常包括酸、堿、氧化、高溫和光照降解 ５ 個方面。一般認為，強制降解條件應結合藥物的性質制定，所采用的強制降解條件（或降解反應的終點）應使藥物所發生的降解途徑接近藥品在真實情景（長期試驗）下所產生的降解。過度降解（或過于劇烈的降解條件）會形成人為或偽降解產物或次級降解產物而失去強制降解研究的意義，同時也給藥物的穩定性分析方法的開發帶來不必要的工作量。無論是仿制藥還是創新藥，其強制降解均應按上述原則進行研究。
已有文獻進行仿制藥強制降解研究的報道，如左氧氟沙星注射液的日本藥品醫療器械管理局（Phamaceuticals and Medical Deviees Ageney PMDA）審評文件中顯示了左氧氟沙星原料藥的強制降解條件，有文獻報道頭孢曲松鈉在酸（３％ 醋酸，室溫30min） 、堿（0.1mol·L-1碳酸氫鈉，60℃下 30min） 降 解 條 件 下 可 得 到 數 量 適 中 的 雜 質等［8-10］。相比仿制藥，創新藥的強制降解研究具有階段性和摸索性的特點，美國FDA鼓勵在新藥Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗階段進行強制降解研究，要求在Ⅲ期臨床 階 段 以 及 新 藥 申 請 （new drug application,NDA）階段應進行強制降解研究，并以年報的方式進行提交[11]。創新藥的光照強制降解試驗可參照ICHQ1Ｂ 中的光照穩定性試驗條件進行，即可見光1.2×106Ix·ｈ，近紫外200Ｗ·ｈ·ｍ-2，對于高溫、酸、堿及氧化降解條件的選擇，指導原則中并未明確［12］，其降解條件選擇可參考藥物強制降解的綜述文獻中推薦的條件進行不斷摸索研究。美國FDA審評員，輝瑞、葛蘭素史克、阿斯利康等國際制藥公司的研發人員認為，5％～ 20％ 的降解是可以接受的，對于含量為標示量90％ ～110％ 的小分子藥物，約10％ 的降解為最佳。對于酸、堿、氧化降解條件，不同文獻推薦的降解條件不同，綜合相關報道［2-7］及經驗，可推薦的酸堿降解條件：藥物質量濃度 0.1 ～ 1.0 ｍｇ·ｍＬ-1，0.1～ 1ｍｏｌ·Ｌ-1鹽酸溶液、硫酸或氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液、氫氧化鋰溶液等，溫度為室溫至70℃，降解時間不過3周；對于氧化降 解：藥 物 質 量 濃 度 為0.1～ 20ｍｇ · ｍＬ-1，0.02％～３％ 過氧化氫溶液，溫度為室溫至30℃ ，降解時間不過1周，當反應溫度超過50℃ ，過氧化氫的Ｏ- Ｏ鍵會斷裂形成自由基，加劇不可預測的降解途徑的形成，另外，過氧化氫的濃度過高可能導致偽降解產物的生成，使得降解研究的意義變得有限。當反應條件提高到上述降解條件的極限時，藥物仍然較穩定或無明顯降解產物生成時，不推薦采用更加劇烈的條件繼續進行試驗［13-14］。
對于固態高溫降解，有文獻［15-16］ 認為與低溫時相比，降解溫度過高時，化合物的降解途徑可能會發生較大的變化，研究此高溫下的降解產物將變的意義不大，因此，高溫降解的溫度通常不宜過高。對于高溫降解的終點判定，一方面需要使得藥物獲得充分地降解；另一方面，美國藥品研究與制造企業協會（ Pharaceutical Research and Manufacturers of Ameri.ca，PhRMA)）認為，高溫降解的能量應不低于樣品在加速條件下（如40℃ ／75％ＲＨ，6個月）所接受的能量［17］，二者之中的任何一種情況首先達到，即可終止降解。一般可根據Arrhenius方程理解和判斷降解條件的選擇，即通常情況下，藥物在固定濕度下的高溫降解動力學過程遵守下式：ｋ＝Aexp（-Ea／ ＲＴ），其中，ｋ為速率常數，A為頻率因子，Ｒ 為摩爾氣體常數，Ｔ為熱力學溫度，Ea為表觀活化能，當化合物的活化能Ea已知時，可以根據此公式推算出不同溫度下的降解速率，如表1示。
Ea實際測定需要進行一系列復雜的工作。可采用保守和激進的估算值對試驗進行預估，例如Ea采用較激進的19.8 kcal·ｍol-1時，當某原料藥或制劑的加 速 試 驗 條 件 為40℃/75%RH放置6個月（180ｄ）時，相當于在70 ℃ 下放置11ｄ（180ｄ ×5.0÷80.6＝11ｄ），60 ℃ 下放置27ｄ；當Ea采用較為保守的17kcal·ｍol-1時，由上表可知，加速條件40℃ ／75，相當于70℃下放置17ｄ（180ｄ ×4.0 ÷ 43.2＝17ｄ），60℃ 下放置35ｄ；當采用更加保守的Ea（12kcal·ｍol-1 ）時，相當于70 ℃下放置33ｄ（180ｄ × 2.6 ÷ 14.3＝33ｄ），60℃下放置56ｄ， 已 有 研 究 報 道 大 多 數 化 合 物 的Ea在20kcal·ｍol-1 以上［18］，所以可采用較為激進的Ea進行預估。需要注意，以上不同溫度之間降解速率的換算需要基于降解反應的濕度保持不變，因此，為了方便估算，建議高溫降解反應的濕度保持與加速條件一致（如75％ ＲＨ）。如果沒有證據表明更加劇烈的溫度會影響藥物的降解途徑，可以采用更高的溫度進行試驗，以節省反應的時間，以 Ea 采用18kcal·ｍol-1 為例，110℃下反應16ｈ 相當于長期條件25℃/60％ＲＨ下放置18個月［19］。
強制降解試驗中應注意考察降解前后的物料平衡、主峰的峰純度及主峰和相鄰雜質的分離度，制劑的強制降解試驗可考慮平行設計空白輔料和原料藥降解試驗，排除二者對制劑的降解試驗干擾。
2、強制降解產物研究
ICHQ1A（R２）指導原則認為，對于創新藥和新制劑，雖然強制降解產物的考察有助于確定降解途徑、幫助開發和驗證適當的分析檢測方法，但如果某強制降解產物被證明未在加速或長期穩定性試驗中產生，則對該強制降解產物的考察可能是沒有必要的。但創新藥強制降解下主要降解產物歸屬的研究，對了解其降解途徑，提前發現潛在致突變降解雜質，評估其安全性和毒性等均具有重要意義。 作為主體責任人，國外多數企業均選擇對創新藥強制降解中的主要產物進行結構確證，以了解藥物的降解途徑和規律［20］。
2.1 主要降解產物的判定
化學仿制藥的降解途徑和主要降解產物已有報道。 如抗流感藥物帕拉米韋注射液原研藥品的主要降解途徑／ 降解雜質在日本PMDA審評文件中已有論述［21］，其主要降解雜質為羧基手性消旋雜質（C-1異構體雜質）；在注射液Q1Q2一致的基礎上，其降解途徑應與原研藥品基本一致，故一般無需再通過對主要降解產物進行歸屬來重復這些背景知識［22］。創新藥的結構新穎，降解途徑未可知，對其強制降解條件下主要降解產物進行歸屬，對了解其降解路線具有重要意義。 目前各國藥品監管部門均無對主要降解產物的判定進行論述，主要降解產物的判斷也應當結合藥物的正式穩定性的研究結果進行判斷。 國外業界所報道的判定方法或觀點如下［19,23-24］：第一種方法是一條經驗性的判斷方法（表2） ，具體規定為對固體樣品，主要降解產物應至少為0.25％ ；對于液體樣品，主要降解產物應至少為1％ ，總降解產物不超過20％ 。 當滿足該前提條 件 時， 可根據下文對主要降解產物 進行判定。
該判定方法具有階段性，規定了不同申報階段的判定標準。 例如，某原料藥在申報臨床試驗申請（ investigational new drug, IND） 階段，在光照條件下降解 了4.46％ ， 分 別 為 雜 質A（0.8％ ） 、 雜 質B（3.0％ ） 、雜質C（0.02％ ） 、雜質 Ｄ（0.04％ ） 、雜質Ｅ（0.1％ ） 和 雜 質 F（ 0.5％ ） 。雜 質 C、 Ｄ、E的 含量 ＜0.25％ ，直接不作為主要降解產物；雜質 Ａ、Ｆ分別占 總 降 解 產 物 的17.9％ （0.8％ ÷ 4.46％ ） 、11.2％ （0.5％ ÷ 4.46％ ） ，大于表中的上限10％ ；另外，２ 個雜質的含量分別為最大降解產物的26.7％（0.8％ ÷ ３. ０％ ，大于限度25％ ）和 16.7％ （0.5％ ÷3.0％ ，小于限度25％ ），所以雜質f不應視為主要降解產物，故雜質A、B為主要降解產物，應進行結構確證；但當該藥物進行NDA申報時，雜質F應進行鑒定（16.7％ ，大于限度10％ ）。另一種方法將ICHQ３Ａ、3Ｂ中的鑒定限與強制降解的鑒定限進行了關聯，一般僅針對高溫固體降解試驗。該判定方法的大致原理：首先，假定高溫固體降解試驗與加速條件40℃ /75％ ＲＨ 放置6個月達到了動力學平衡；其次，保守估計若藥物在貨架期內降解了 ２％ ，如在強制降解試驗中應降解5％ ～10％ ，經計算，后者是前者的2.5~5倍，取其中較大的倍數５。當以ICHQ3Ｂ中的鑒定限為基數再乘以相應的 5倍時，則可以推導出強制降解中的鑒定限（表 ３）。
需要說明的是，如表中所示，如強制降解試驗僅降解了1％～5％ ，是貨架期降解的0.5~2.8倍，取其中較大的倍數2.5倍， 則強 制降 解 的 鑒 定 限 為ICHQ3Ｂ鑒定限乘以2.5。例如，某片劑最大日劑量800ｍｇ，在高溫降解 （70℃ ，11 ｄ） 下與加速條件40℃ ／75％ＲＨ 放置6個月達到了動力學平衡，降解產物量為2％，則該強制降解研究中，主要降解產物為 ＞0.5％ 的降解物。
2.2 降解產物的結構確證
應隨著創新藥研發的進展不斷完善主要降解產物的結構確證研究。反相高效液相色譜（RP-HPLC）是強制降解研究常用的分離手段，經過評估確定的主要降解產物通常采用液相色譜 － 質譜聯用儀（LC-MS） 進行結構確證，如主要降解產物降解量足夠大，也可通過制備色譜柱對其進行分離，再結合其他技術手段（如核磁共振 ＮＭＲ、紅外光譜ＩＲ、質譜MS等）進行進一步確證。由于常用的RP-HPLC液相條件通常含有非揮發性的緩沖鹽，故采用LC-MS進行結構確證時，可使用具有相似 ｐＨ 緩沖范圍的揮發性緩沖鹽對其進行代替，如PH 5.5~8的RP-HPLC流動相可在LC-MS采用PH 約為6.8 的10 ｍｍｏI·Ｌ-1醋酸銨溶液代替，并可以通過添加適當醋酸或氨水調節PH，常用的RP-HPLC的替代流動相見表4。需要注意LC-MS條件下 的 液 相 色 譜 保 留 組 分 與RP-HPLC的對應關系，一般來說，若LC-MS方法中流動相的PH與原始方法能基本保持一致，則二者的流出特征通常非常類似［25］。
2.3 致突變降解產物研究
ICH M 7（Ｒ2）主要適用于 創 新 藥， 指 出 潛 在 降 解 產 物 包 括 加 速 試 驗 和ICHQ1Ｂ光照穩定性試驗下形成的超過ICHQ３A、３B鑒定限的產物，不論實際降解產物還是潛在降解產物，只要鑒定出了結構，均應對其進行致突變性評估［26］，化學降解原理、強制降解研究可幫助選擇潛在降解產物。可見，對于創新藥而言，對強制降解條件下主要降解產物進行歸屬有助于識別其可能產生的致突變降解產物，并擬定合理的策略予以預防。例如，芳基酰胺結構類藥物（如對乙酰氨基酚） 、含有吡啶基團的藥物（如質子泵抑制劑） 、酚類藥物（如丙泊酚）分別容易在水解、氧化條件下降解產生致突變警示結構的芳香胺，N-氧化物和醌類藥物等，在產品開發過程應注意選擇合適的PH，關注產品的包裝形式是否需要隔氧、遮光等，應結合長期穩定性試驗結果對包括光照強制降解條件下的降解產物的致突變性進行評估，當降解產物最終鑒定為致突變雜質而在實際儲存條件下未檢出時，可以不進行進一步評估，但需要注意分析方法靈敏度是否能達到要求；當實際儲存條件下有檢出且高于安全限度時，應該采取控制措施降低風險。
3、小結
藥物強制降解研究包括酸、堿、氧化、高溫和光照降解5個方面，化學創新藥的強制降解研究有利于加強研發人員對其降解途徑、機制的理解，并驗證所用分析方法的指示能力。對于光照試驗條件，ICH指導原則已經有了較明確的規定；對于高溫、酸、堿、氧化反應試驗，極限條件的確定需要結合藥物的結構性質以及一般允許的降解程度去判斷，主要降解產物的判斷也應當結合藥物正式穩定性的研究結果和國際經驗，合理的強制降解產物的結構確證加強了對藥物降解路線的確定，同時，隨著ICHＭ７(Ｒ2）的實施，強制降解研究也對致突變雜質的評估起著重要的作用。
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來源：藥物分析雜志
