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奧硝唑為目前常用的抗厭氧菌藥物，作為繼甲硝唑和替硝唑后的第三代抗厭氧菌感染藥物，療效穩定，副作用小[1-2]。左奧硝唑作為奧硝唑的單一對映體，與現有的奧硝唑相比，其副反應更小[3]。但臨床上使用的奧硝唑、左奧硝唑水溶性極差，做成輸液制劑時pH值在3.5左右（人體耐受pH為4.0~9.0），患者用藥時易產生靜脈炎[4-5]，且輸液高溫滅菌時會產生較高的毒性降解產物2-甲基-5硝基咪唑[6]，臨床用藥安全性較差。磷酸左奧硝唑酯二鈉是對左奧硝唑進行化學結構修飾形成的新的化合物[7-8]，藥代動力學研究表明磷酸左奧硝唑酯二鈉在體內可以迅速分解為左奧硝唑[9]。磷酸左奧硝唑酯二鈉制備成靜脈給藥制劑時提高了藥物的水溶性，pH值為5.5左右，動物實驗表明不會產生靜脈炎[10-11]，且雜質研究發現不會產生毒性降解產物2-甲基-5硝基咪唑[12]。磷酸左奧硝唑酯二鈉為注射用磷酸左奧硝唑酯二鈉的原料藥，現根據《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2015年版通則1143[13]對磷酸左奧硝唑酯二鈉進行細菌內毒素檢查法的研究，為建立該品種的細菌內毒素檢查法提供科學依據。

 

1 材料

 

1.1 儀器

TAL-40D型干式恒溫器（湛江安度斯生物有限公司）；IKA MS3型自動漩渦混合器（廣州儀科實驗室技術有限公司）；FED400型干燥箱（德國賓德公司）；XSE205DU型電子天平（梅特勒-托利多公司）；其他器皿包括試管、微量移液器及微量移液器配套的槍頭（無熱原）等。

 

1.2 藥品與試劑

磷酸左奧硝唑酯二鈉（揚子江藥業集團江蘇海慈生物藥業有限公司，批號18011001、18011101、18011201）；鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，0.25 EU·mL-1，批號1901161；0.125 EU·mL-1，批號1901212。福州新北生化工業有限公司，0.25 EU·mL-1，批號18040712；0.125 EU·mL-1，批號18090512；規格0.1 mL/支）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號150601-201885，規格80 EU/支）；細菌內毒素檢查用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，批號1812210，規格50 mL/瓶）。

 

2 方法與結果

 

2.1 鱟試劑靈敏度復核試驗

 

根據4批鱟試劑靈敏度的標示值（λ），將細菌內毒素工作標準品用BET水溶解，置漩渦混合器上混勻15 min，然后制成濃度為2 λ、1λ、0.5 λ和0.25 λ 4個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在漩渦混合器上混合30 s，按《中國藥典》2015年版通則1143細菌內毒素檢查法[5]復核本試驗所用鱟試劑的靈敏度，結果4批鱟試劑靈敏度的測定值（λc）均在0.5 ~ 2.0 λ范圍內，符合《中國藥典》規定，可用于細菌內毒素檢查，詳見表 1和表 2。

 

表 1 鱟試劑靈敏度復核結果（0.25 EU·mL-1）

 

 

 

 表 2 鱟試劑靈敏度復核結果（0.125 EU·mL-1）

 

2.2 供試品最大有效稀釋倍數（MVD）的確定

 

根據細菌內毒素檢查法（《中國藥典》2015年版二部附錄Ⅺ E），L=K/M，K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量。本品制成注射劑規格為0.2 g/支，臨床用藥量為每日8支，使用方式為靜脈滴注，給藥時間為1~2 h，故擬使用日劑量為1600 mg·h-1。則K=5 EU/（kg·h），供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉換為每千克體質量（M），人體表面積按1.62 m2計算，L=0.19 EU·mg-1。為保證用藥安全，本企業對細菌內毒素限值嚴格控制，至計算值的1/5，確定磷酸左奧硝唑酯二鈉的細菌內毒素限值為每1 mg中含有內毒素的量應小于0.04 EU。

 

稱取供試品適量，加BET水溶解，配成初始濃度c=50 mg·mL-1的供試品溶液，按《中國藥典》2015年版通則1143細菌內毒素檢查法[5]的規定，MVD=cL/λ，計算各靈敏度鱟試劑對應的樣品最大有效稀釋倍數：MVD0.25=8（6.25 mg·mL-1）、MVD0.125=16（3.125 mg·mL-1）、MVD0.06=32（1.562 mg·mL-1）、MVD0.03=64（0.781 mg·mL-1）；在不超過對應MVD的稀釋倍數下進行細菌內毒素檢查。

 

2.3 預干擾試驗

 

用靈敏度為0.25 EU·mL-1的鱟試劑，對不超過64倍稀釋（即不低0.781 mg·mL-1）的不同濃度的供試品溶液進行干擾預試驗，以確定樣品的不干擾濃度。稱取磷酸左奧硝唑酯二鈉242.30 mg，批號：18011001，加4.85 mL BET水溶解，配成初始濃度c=50 mg·mL-1的供試品溶液，再將供試品溶液稀釋至不超過MVD的一系列稀釋倍數，分別為8倍、16倍、32倍、64倍，得一系列稀釋濃度：c1=6.25 mg·mL-1，c2=3.125 mg·mL-1，c3=1.562 mg· mL-1，c4=0.781 mg·mL-1。對這些濃度的供試品溶液進行細菌內毒素檢測預干擾試驗，將供試品溶液記作NPC，供試品陽性對照溶液記作PPC，同時做2支陽性對照管PC及2支陰性對照管NC，結果見表 3。

 

表 3 樣品預干擾試驗結果

 

由表 3結果可知，供試品溶液（原液）的稀釋濃度在0.781~6.25 mg·mL-1時，對鱟試劑與細菌內毒素反應無干擾作用，且試驗結果有效。則可選用靈敏度不低于0.25 EU·mL-1的鱟試劑進行正式干擾試驗。

 

2.4 干擾試驗

 

根據預干擾試驗結果，選用靈敏度為0.125 EU·mL-1的鱟試劑進行正式干擾試驗。稱取3個批號的磷酸左奧硝唑酯二鈉，加BET水溶解得初始濃度c=50 mg·mL-1的供試品溶液，再用BET水稀釋至對內毒素檢測無干擾濃度的供試品溶液c=6.25 mg·mL-1。將細菌內毒素標準品用BET水逐步配制成5個濃度的標準品溶液，即4 λ（0.5 EU·mL-1）、2 λ（0.25 EU·mL-1）、λ（0.125 EU·mL-1）、0.5 λ（0.0625 EU·mL-1）、0.25λ（0.0312 EU·mL-1）。按細菌內毒素檢查法進行干擾試驗，結果見表 4。

 

表 4 樣品干擾試驗結果

  

由表 4結果可知，平行3批次干擾試驗中，陰性對照溶液NC、供試品溶液NPC的所有平行管均為陰性；兩個廠家鱟試劑標示靈敏度對照系列的結果λc在0.5 λ~2 λ之間（包括0.5 λ和2 λ），符合鱟試劑靈敏度復核實驗要求，試驗有效。兩個廠家鱟試劑干擾試驗系列的結果Et在0.5 λ~2 λ之間（包括0.5 λ和2 λ），符合規定。說明供試品溶液稀釋至6.25 mg·mL-1時，采用靈敏度λ為0.125 EU·mL-1的鱟試劑進行試驗無干擾，可用于細菌內毒素檢查。

其中：Xs，Xt分別為鱟試劑標示靈敏度對照溶液和干擾試驗溶液的反應終點濃度的對數值。

 

2.5 樣品細菌內毒素檢查

 

稱取3個批號的供試品，加BET水溶解，配成50 mg·mL-1的供試品溶液。分別再用BET水稀釋8倍，使用λ為0.125 EU·mL-1的鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司），按所建立方法進行細菌內毒素檢查，結果見表 5。

 

表 5 樣品細菌內毒素檢查結果

 

由表 5結果可知，陰性對照溶液NC的平行管都為陰性，陽性對照溶液PC的平行管都為陽性，供試品陽性溶液PPC的平行管都為陽性時，試驗有效。供試品溶液NPC的平行管都為陰性，供試品符合規定。

 

3 討論

 

細菌內毒素檢查法作為替代熱原檢查法的一種檢測方法，具有簡便、靈敏、快速、準確等優點[14-15]。通過預干擾試驗可以分析不同樣品質量濃度對鱟試劑與細菌內毒素凝集反應的干擾程度，初步篩選出對內毒素反應無干擾作用的濃度范圍[16]。而后通過干擾試驗，對篩選出的無干擾質量濃度進行進一步確認[17-18]。為了證實該濃度下，不同廠家的鱟試劑均能對本樣品進行檢測，本試驗采用兩個不同廠家的鱟試劑（λ=0.125 EU·mL-1）對3個批次的樣品進行試驗[19-20]。本次試驗結果表明，磷酸左奧硝唑酯二鈉制備成供試品溶液并稀釋至6.25 mg·mL-1及以下濃度后，用靈敏度為0.125 EU·mL-1的鱟試劑進行檢查，無干擾作用。因此，磷酸左奧硝唑酯二鈉用凝膠法進行細菌內毒素檢查，方法可行。

 

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