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嘉峪檢測網(wǎng) 2024-11-04 17:10
本文的目的是為了探討注射用甲苯磺酸奧馬環(huán)素的無菌方法開發(fā)及驗(yàn)證。通過采用薄膜過濾法，使用1mol·L-1硫酸鎂溶液對樣品及所用培養(yǎng)基進(jìn)行處理，pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液（含 0.1% 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）進(jìn)行沖洗，有效地消除了樣品的抑菌性。得出的結(jié)論為采用 1 mol·L-1 硫酸鎂溶液及 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液（含 0.1% 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）可以有效地消除注射用甲苯磺酸奧馬環(huán)素的抑菌性能，可以將該方法用于注射用甲苯磺酸奧馬環(huán)素的無菌方法驗(yàn)證。
注射用甲苯磺酸奧馬環(huán)素的主要成分是甲苯磺酸奧馬環(huán)素。甲苯磺酸奧瑪環(huán)素是一種新型的廣譜抗生素，屬于環(huán)素類抗生素家族。它通過抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成來發(fā)揮抗菌作用。甲苯磺酸奧瑪環(huán)素的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被細(xì)菌產(chǎn)生的酶類破壞，因此能夠有效應(yīng)對一些對常規(guī)抗生素產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌。甲苯磺酸奧瑪環(huán)素的抗菌活性廣泛且強(qiáng)大，尤其是對多重耐藥菌的抑制作用顯著。它對多種常見的致病菌，如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等，均顯示出良好的抗菌效果。此外，甲苯磺酸奧瑪環(huán)素還能夠有效應(yīng)對一些對其他抗生素產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）等。
甲苯磺酸奧馬環(huán)素是一種有機(jī)化合物，分子式為 C29H40N4O7 · C7H8O3S，是一種醫(yī)藥原料藥，是白色至黃色的固體，能溶于二甲基亞砜。
中國藥典 四部 1105 表2 常見干擾物的中和劑或滅活方法中喹諾酮類抗生素可選用的中和劑為鎂或鈣離子[1]。王靜[2]等人在抗生素類藥品無菌檢查方法的研究進(jìn)展中就薄膜過濾法中的沖洗選用了卵磷脂和吐溫、 二價(jià)金屬離子（如鎂離子、鈣離子和錳離子等）作為中和劑中和抗生素類藥品的抑菌性。鄒曉平[3]等人在頭孢西丁鈉無菌檢查消除抑菌性的研究中加入 β- 內(nèi)酰胺酶來消除頭孢西丁鈉的抑菌活性。劉健[4] 等人在無菌檢查時(shí)消除美羅培南的抑菌性一文中采用加大人工振蕩和增加沖洗次數(shù)的薄膜過濾法消除美羅培南的抑菌性。王君[5]等人在 β- 環(huán)糊精溶液在注射用德拉沙星無菌檢查中的應(yīng)用中聯(lián)合使用了β- 環(huán)糊精溶液和無菌氯化鎂溶液，消除德拉沙星的抑菌作用。
1、消除抑菌活性的方法
消除供試品的抑菌活性是無菌測試方法驗(yàn)證中的難點(diǎn)。供試液接種后，按規(guī)定的方法進(jìn)行培養(yǎng)。與對照管比較，如含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，需要采用適宜的方法消除供試品的抑菌活性。對于具有抑菌活性的供試品，為了消除供試品的抑菌性應(yīng)盡量選擇操作簡便、快速的方法，同時(shí)所選用的方法應(yīng)避免損傷供試品中污染的微生物。對于抑菌活性比較強(qiáng)的供試品，在供試品溶液性狀允許的情況下，應(yīng)盡量選用薄膜過濾法[1]。
無菌檢查中消除抑菌活性的方法有：稀釋法、薄膜過濾法、加入適宜的中和劑或滅活劑，對于抑菌性強(qiáng)的供試品，可聯(lián)合使用上述方法去除抗菌活性。
2、試驗(yàn)程序
文中所用培養(yǎng)基參照 2020 年版1101 無菌檢查中關(guān)于培養(yǎng)基的要求進(jìn)行無菌性和靈敏度檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。所用菌株均為采購的 3 代商業(yè)定量菌株。
2.1樣品信息（見表1）
表1 樣品信息
2.2試驗(yàn)儀器和材料
（見表2、表3、表4及表5）
表2 試驗(yàn)中的儀器設(shè)備
表3 試驗(yàn)中的耗材
表4 試驗(yàn)中的培養(yǎng)基和試劑
表5 試驗(yàn)中的菌株
2.3方法開發(fā)試驗(yàn)
按照《中國藥典》2020 年版，該樣品的批產(chǎn)量大于 500 瓶，每瓶的裝 100 mg。按《中國藥典》2020 年版四部通則 1101 無菌檢查法，供試品接種每種培養(yǎng)基的最少檢驗(yàn)數(shù)量為 20 瓶，每瓶供試品接入每種培養(yǎng)基的最少檢驗(yàn)量為 50 mg。
由于注射用甲苯磺酸奧馬環(huán)素的抑菌性較強(qiáng)，為了節(jié)約樣品，使用 1 支樣品進(jìn)行小試，小試成功后再進(jìn)行放大試驗(yàn)。
2.3.1 預(yù)試驗(yàn)一
2.3.1.1. 取 1 支樣品，用 3 mL（含0.1% 吐溫 80）的 0.1% 無菌蛋白胨水溶液溶解，轉(zhuǎn)移至（含 0.1% 吐溫 80）的 0.1% 無菌蛋白胨水溶液至 100 mL。
2.3.1.2. 先用適量的沖洗液沖洗集菌器濾膜，使濾膜潤濕。將上述樣品溶液過濾。用500 mL（含0.1%吐溫80）的0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，每次沖洗液用量為 100 mL。在最后一次使用的沖洗液中加入不大于 100 cfu 的金黃色葡萄球菌，進(jìn)行過濾。過濾結(jié)束后，泵入100 mL 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基。
2.3.1.3. 用緩沖液代替供試品，操作同 2.3.1.2.。
2.3.1.4. 試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)組無菌生長，菌液組生長良好。
2.3.2 預(yù)試驗(yàn)二
2.3.2.1. 取 1 支樣品，用 3 mL 無菌水復(fù)溶，加入一支 Ca(OH)2 緩沖液，混勻，轉(zhuǎn)移至 100 mL pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液中，制得供試液。
2.3.2.2. 先用適量的沖洗液沖洗集菌器濾膜，使濾膜潤濕。將上述樣品溶液過濾。用 300 mL pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗液用量為100 mL。在最后一次沖洗液中加入不大于 100 cfu 的金黃色葡萄球菌，過濾。過濾結(jié)束后，泵入 100 mL 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基。
2.3.2.3. 用緩沖液代替供試品，操作同 2.3.2.2。
2.3.2.4. 試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)組較菌液組生長緩慢，第 3 天時(shí)長勢接近。證明Ca(OH)2 對消除樣品中的抑菌性有一定的作用。
2.3.3 預(yù)試驗(yàn)三
2.3.3.1. 取 2 支樣品，一支用 0.6 mL的（含 0.1 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3%吐溫 80）的 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液溶解，一支用 3 mL 的（含 0.1 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）的 pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液溶解，混勻，過濾。
2.3.3.2. 先用適量的沖洗液沖洗集菌器濾膜，使濾膜潤濕。將上述樣品溶液過濾。用 900 mL（含 0.1 組氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐溫 80）的 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液溶解沖洗濾膜，每次沖洗液用量為 100 mL。在最后一次使用的沖洗液中加入不大于 100 cfu 的金黃色葡萄球菌，進(jìn)行過濾。過濾結(jié)束后，泵入 100 mL 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基。
2.3.3.3. 用緩沖液代替供試品，操作同 2.3.2.2。
2.3.3.4. 試驗(yàn)結(jié)果：與菌液對照組相比，試驗(yàn)組生長緩慢，在第 3 天時(shí)長勢接近菌液組。結(jié)果觀察中發(fā)現(xiàn)用 3 mL溶解液復(fù)溶樣品的試驗(yàn)組較用 0.6 mL溶解液復(fù)溶樣品的試驗(yàn)組生長更好。證明緩沖液中所加的 0.1 組氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐溫 80 對消除樣品中的抑菌性有一定的作用。
2.3.4 預(yù)試驗(yàn)四
考慮到 Ca(OH)2 和 0.1 組氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐溫 80 對消除樣品的抑菌性都具有一定的作用，但分別使用時(shí)效果不明顯，以上兩種方式聯(lián)合使用。
2.3.4.1. 取1支樣品，pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液溶解，加入一支Ca(OH)2 緩沖液，混勻，制得供試液。
2.3.4.2. 先用適量的沖洗液沖洗集菌器濾膜，使濾膜潤濕。將上述樣品溶液過濾。用 900 mL（含 0.1 組氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐溫 80）的 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗液用量為 100 mL。在最后一次使用的沖洗液中加入不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌。
2.3.4.3. 用緩沖液代替供試品，操作同 2.3.4.2。
2.3.4.4. 試驗(yàn)結(jié)果：與菌液對照組相比較，試驗(yàn)組生長良好。
2.3.5 預(yù)試驗(yàn)五：放大開發(fā)
2.3.5.1. 取 10 支樣品，每支用 5 mL飽和的 Ca(OH)2 水溶液溶解，混勻，振蕩，合并溶解液至 100 mL pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液中，制得供試液。
2.3.5.2. 先用適量的沖洗液沖洗集菌器濾膜，使濾膜潤濕。將上述樣品溶液過濾。用 500 mL（含 0.1 組氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐溫 80）的 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗液用量為 100 mL。在最后一次使用的沖洗液中加入不大于 100 cfu 的金黃色葡萄葡萄球菌。
2.3.5.3. 用緩沖液代替供試品，操作同 2.3.5.2。
2.3.5.4. 試驗(yàn)結(jié)果：與菌液對照組相比較，試驗(yàn)組雖有菌生長，但生長緩慢且微弱。
2.3.6 預(yù)試驗(yàn)六
考慮到飽和的 Ca(OH)2 在 0℃時(shí)的溶解度是 0.18 g，溶解度較小，更換為硫酸鎂溶液繼續(xù)放大開發(fā)。
2.3.6.1. 取 10 支樣品，每支用 5 mL1 mol · L-1 的 MgSO4 水溶液溶解，混勻，振蕩，合并溶解液至 100 mL pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液中，制得供試液。
2.3.6.2. 先用適量的沖洗液沖洗集菌器濾膜，使濾膜潤濕。將上述樣品溶液過濾。用 500 mL（含 0.1 組氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐溫 80）的 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗液用量為 100 mL。在最后一次使用的沖洗液中加入不大于 100 cfu 的金黃色葡萄葡萄球菌。
2.3.6.3. 用緩沖液代替供試品，操作同 2.3.6.2。
2.3.6.4. 試驗(yàn)結(jié)果：與菌液對照組相比，試驗(yàn)組生長良好。
2.3.7 結(jié)論
通過以上6組預(yù)實(shí)驗(yàn)，證明用1 mol · L-1 的 MgSO4 與（含 0.1 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）的 pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，以上兩者聯(lián)用，可以消除注射用甲苯奧馬環(huán)素的抑菌性。為了使樣品中 1 mol · L-1 的MgSO4 的含量更多，試驗(yàn)組能更好的生長且對微生物無毒，在不改變 MgSO4 濃度條件下，對硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)處理。
3、驗(yàn)證步驟
3.1供試液制備
取20瓶注射用甲苯磺酸奧馬環(huán)素（規(guī)格為100mg/ 瓶）， 每瓶加入5mL 1mol·L-1 硫酸鎂溶液，振蕩數(shù)次，供試品完全溶解后，每瓶取 2.5 mL，合并至 100 mL pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液（含 0.1% 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）中，制得供試品溶液。共制備 6 份。
3.2培養(yǎng)基預(yù)處理
每 100 mL FTM 培養(yǎng)基中加入10 mL 1 mol · L-1 硫酸鎂溶液，共制備 7份；每 100 mL TSB 培養(yǎng)基中加入 10 mL1 mol · L-1 硫酸鎂溶液，共制備 7 份，振蕩數(shù)次，混勻待用。
3.3試驗(yàn)組
3.3.1. 取少量 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液（含 0.1% 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）過濾以潤濕濾膜。
3.3.2. 將制備好的供試品溶液過濾，再用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（含0.1% 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫80）沖洗，分 5 次，每次 100 mL。在最后一次的沖洗液中加入 0.1 mL 的102 ～ 103 cfu/mL 金黃色葡萄球菌（不大于 100 cfu），過濾。同法，試驗(yàn)菌換成大腸埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉，過濾。
3.3.3. 過濾完成后，加培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)，接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和生孢梭菌的濾筒內(nèi)加入 100 mLFTM，接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的濾筒內(nèi)加入 100 mL TSB。
3.4陽性對照組
用緩沖液代替供試液，操作同3.3.1-3.3.3。
3.5陰性對照組
3.5.1. 取少量 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液（含 0.1% 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）過濾以潤濕濾膜。
3.5.2. 用緩沖液代替供試液過濾，再用 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液（含0.1% 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫80）沖洗，分 5 次，每次 100 mL。同法共制備 2 支無菌檢測筒。
3.6培養(yǎng)
將胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基和硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，置規(guī)定溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不得超過 5 天。
3.7菌液計(jì)數(shù)
分別注入 0.1 mL 的 102 ～ 103 cfu/mL 試驗(yàn)菌到培養(yǎng)基表面并用涂布棒涂布均勻（每種試驗(yàn)菌平行制備 2 個(gè)計(jì)數(shù)平板）。
金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌和生孢梭菌計(jì)數(shù) TSA 于30 ～ 35℃培養(yǎng)不超過 3 天；白色念珠菌和黑曲霉計(jì)數(shù) TSA 于 30 ～ 35℃培養(yǎng)不超過 5 天。
生孢梭菌使用厭氧產(chǎn)氣袋和厭氧指示劑置于培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，其他試驗(yàn)菌在培養(yǎng)箱中需氧培養(yǎng)。
3.8結(jié)果觀察
觀察培養(yǎng)結(jié)果，若澄清則無菌生長；若渾濁，需要記錄生長情況：生長良好或者生長微弱、緩慢或不生長。
4、驗(yàn)證結(jié)果
注射用甲苯磺酸奧馬環(huán)素的無菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證，采用薄膜過濾法，對1 批次注射用甲苯磺酸奧馬環(huán)素進(jìn)行 3次獨(dú)立無菌驗(yàn)證，檢驗(yàn)量為半量。3 次試驗(yàn)結(jié)果均為陰性對照組無菌生長；陽性對照組各試驗(yàn)菌生長良好；與陽性對照組比較，試驗(yàn)組各試驗(yàn)菌生長良好；各試驗(yàn)菌菌液計(jì)數(shù)平均菌落數(shù)均不大于100 cfu/ 皿，符合要求。無菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果詳見表 6、表 7、表 8。
表6 第一次無菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果
表7 第二次無菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果
表8 第三次無菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果
5、結(jié) 論
使用 1 mol · L-1 的 MgSO4 溶解樣品，薄膜過濾后，再用 500 mL（含 0.1 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）的 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，在泵入的100 mL FTM 和 TSB 中各加入 10 mL 的1 mol · L-1 的 MgSO4 混勻，此方法可以有效地消除注射用甲苯奧馬環(huán)素的抑菌性并用于注射用甲苯奧馬環(huán)素的無菌驗(yàn)證。
參考文獻(xiàn)
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來源：制藥工藝與裝備
